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Estructura Primaria de las Proteínas

La estructura primaria de péptidos y de proteínas se refiere al número lineal y al orden de los aminoácidos presentes. La convención para la designación del orden de los aminoácidos es que el extremo N-terminal (es decir, el extremo que lleva el residuo con el grupo α-amino libre) está al extremo izquierdo (y el aminoácido número 1) y el extremo C-terminal (es decir, el extremo con el residuo que contiene al grupo α-carboxilo libre) está a la derecha.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

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Estructura Secundaria de las Proteínas

El arreglo ordenado de aminoácidos en una proteína le confiere formas de conformación regular a esa proteína. Esta conformación constituye la estructura secundaria de una proteína. En general las proteínas se doblan en dos amplias clases de estructuras llamadas proteínas globulares o proteínas fibrosas. Las proteínas globulares se doblan y enrollan de manera compacta, mientras que, las proteínas fibrosas son más filamentosas o alargadas. El carácter de la unión doble parcial del enlace peptídico define las conformaciones que una cadena polipeptídica puede asumir. En una proteína diversas regiones de la cadena del polipéptido pueden asumir diferentes conformaciones determinadas por la secuencia primaria de los aminoácidos.

α-Hélice

La α-hélice es una estructura secundaria común que se encuentra en proteínas de la clase globular. La formación de la α-hélice es espontánea y se estabiliza por uniones de hidrogeno entre los nitrógenos de la amida y los carbones del carbonil de los enlaces peptídicos que están separados por cuatro residuos de aminoácidos. Esta orientación de los puentes de H produce un enrollamiento helicoidal del péptido de tal forma que los grupos-R se encuentren hacia el exterior de la hélice y perpendiculares a su eje.

Una típica estructura de α-hélice

α-hélice típica

No todos los aminoácidos favorecen la formación de la α-hélice debido a las limitaciones estéricas de los grupos-R. Los aminoácidos tales como A, D, E, I, L y M favorecen la formación de α-hélices, mientras que, los aminoácidos G y P favorecen la interrupción de la hélice. Esto es particularmente cierto para P puesto que es un imino ácido basado en pirrolidina (HN=) cuya estructura restringe significativamente el movimiento sobre el enlace del péptido en el cual está presente, de tal modo, que interfiere con la extensión de la hélice. La interrupción de la hélice es importante pues introduce el plegamiento adicional del polipéptido para permitir la formación de proteínas globulares.

Hojas-β

Mientras que una α-hélice se compone de un solo arreglo lineal helicoidal de aminoácidos, las hojas-β se componen de 2 o más diferentes regiones de secuencias de por lo menos 5-10 aminoácidos. El plegamiento y la alineación de las secuencias del polipéptido están una junto a la otra para formar hojas-β que son estabilizadas por puentes de H entre los nitrógenos de la amida y los carbones del carbonil. Sin embargo, los puentes de H están presentes en las secuencias adyacentes opuestas del polipéptido esto es opuesto a la región contigua lineal de la α-hélice. Se dice que las hojas-β son plegadas. Esto se debe a la posición de los carbonos α del enlace peptídico el cual se alterna por encima y debajo del plano de la hoja. Las hojas-β son tanto paralelas como antiparalelas. En las hojas paralelas las cadenas adyacentes del péptido proceden en la misma dirección (es decir, la dirección de los extremos N-terminal y C-terminal es la misma), mientras que, en las hojas antiparalelo las cadenas adyacentes se alinean en direcciones opuestas. Las hojas-β se pueden representar en formato de bola y palillo o como cintas en ciertos formatos de la proteína.

Representación de bola y palillo de una hoja-β

Representación de bola y palillo de una hoja-β


Súper Estructura Secundaria

Algunas proteínas contienen una organización ordenada de las estructuras secundarias que forman dominios funcionales distintos o motivos estructurales. Los ejemplos incluyen el dominio de hélice-vuelta-hélice de las proteínas bacterianas que regulan la transcripción y los reguladores de transcripción de eucariotes, el cierre de leucina, la hélice-asa-hélice y los dominios de zinc.

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Estructura Terciaria de las Proteínas

La estructura terciaria se refiere a la estructura tridimensional completa de las unidades del polipéptido de una proteína dada. Se incluye en esta descripción la relación espacial de diferentes estructuras secundarias dentro de una cadena polipeptídica y cómo estas estructuras secundarias por ellas mismas se doblan en formas tridimensionales de la proteína. Las estructuras secundarias de proteínas a menudo constituyen dominios distintos. Por lo tanto, la estructura terciaria también describe la relación de diversos dominios dentro de una proteína. Las interacciones de diversos dominios son gobernadas por varias fuerzas: Éstas incluyen uniones de hidrógeno, interacciones hidrofóbicas, interacciones electrostáticas y las fuerzas de van der Waals.

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Fuerzas que Controlan la Estructura de la Proteína

Uniones de hidrógeno:

Los polipéptidos contienen numerosos donantes y receptores de protones tanto en su esqueleto como en los grupos-R de los aminoácidos. El medio ambiente en el cual se encuentran las proteínas también contiene donantes y receptores de uniones de H en las moléculas de agua. La unión de H, por lo tanto, ocurre no solamente en y entre las cadenas del polipéptido sino también con el medio acuoso circundante.

Fuerzas hidrofóbicas:

Las proteínas se componen de los aminoácidos que contienen grupos-R hidrofílicos o hidrofóbicos. Es la naturaleza de la interacción de los diversos grupos-R con el ambiente acuoso lo que juega un papel importante para dar forma a la estructura de la proteína. El estado espontáneo de las proteínas globulares es el resultado de un balance entre la energía opuesta de las uniones de H entre los grupos-R hidrofílicos y el medio ambiente acuoso y la repulsión desde el medio ambiente acuoso de los grupos-R hidrofóbicos. La hidrofobicidad de ciertos grupos-R del aminoácido tiende a conducirlos del exterior de las proteínas al interior. Esta fuerza restringe las conformaciones disponibles en las que una proteína puede doblarse.

Fuerzas electrostáticas:

Las fuerzas electrostáticas son principalmente de tres tipos; carga-carga, carga-dipolo y dipolo-dipolo. Las interacciones típicas carga-carga que favorecen el plegamiento de la proteína son aquellas entre grupos-R cargados en forma opuesta tales como K o R y D o E. Un componente substancial de la energía implicada en el plegamiento de la proteína es la interacción de carga-dipolo. Esto se refiere a la interacción de grupos-R ionizados de aminoácidos con el dipolo de la molécula de agua. El dipolo leve transitorio que existe en los grupos-R polares de los aminoácidos también influye su interacción con el agua. Es, por lo tanto, comprensible que la mayoría de los aminoácidos encontrados en las superficies exteriores de las proteínas globulares contengan a grupos-R polares o cargados.

Fuerzas de van der Waals:

Hay fuerzas de van der Waals de atracción y repulsión que controlan el plegamiento de las proteínas. Las fuerzas de atracción de van der Waals implican las interacciones entre los dipolos inducidos que se presentan de fluctuaciones en las cargas de las densidades que ocurren entre los átomos adyacentes no–enlazados y no-cargados. Las fuerzas de repulsión de van der Waals implican las interacciones que ocurren cuando los átomos no-enlazados y no cargados se acercan pero no inducen dipolos. La repulsión es el resultado de la repulsión del electrón-electrón que ocurre mientras que dos nubes de electrones comienzan a traslaparse.

Aunque las fuerzas de van der Waals son extremadamente débiles, en relación a otras fuerzas que gobiernan la conformación de la proteínas, es el gran número de tales interacciones que ocurren en las grandes moléculas de la proteína que hacen que estas fuerzas sean significativas al plegamiento de las proteínas.

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Estructura Cuaternaria

Muchas proteínas contienen 2 o más cadenas diferentes de polipéptidos que están sostenidas en asociación por las mismas fuerzas no covalentes que estabilizan las estructuras terciarias de las proteínas. Las proteínas con cadenas polipeptídicas múltiples son proteínas oligoméricas. La estructura formada por la interacción monómero-monómero en una proteína oligomérica se conoce como estructura cuaternaria.

Las proteínas oligoméricas se pueden componer de cadenas polipeptídicas idénticas múltiples o de cadenas polipeptídicas distintas múltiples. Las proteínas con las subunidades idénticas se llaman homooligomeros. Las proteínas que contienen varias cadenas distintas polipeptídicas se llaman heterooligomeros.

Hemoglobina, la proteína que lleva el oxígeno de la sangre, contiene dos subunidades α y dos subunidades β dispuestas en una estructura cuaternaria en la forma, α2β2. La hemoglobina es, por lo tanto, una proteína heterooligomerica.

Estructura cuaternaria de la hemoglobina

Estructura de la hemoglobina

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Complejo de las Estructuras de las Proteínas

Las proteínas también se encuentran covalentemente conjugadas con los carbohidratos. Estas modificaciones ocurren luego de la síntesis (traducción) de proteínas y, por lo tanto, se llaman modificaciones post-translación. Estas formas de modificación imparten funciones especializadas sobre las proteínas resultantes. Las proteínas covalentemente asociadas a los carbohidratos se llaman glicoproteínas. Las glicoproteínas son de dos clases, N-ligando y O-ligando, refiriéndose al sitio de unión covalente de las estructuras de azúcar. Los azucares unidos al N se unen al nitrógeno amida del grupo-R de la asparragina; los azucares unidos al O se unen a los grupos hidroxilo de serina o de treonina y ocasionalmente al grupo hidroxilo del aminoácido modificado, hidroxilisina.

Hay glicoproteínas extremadamente importantes encontradas en la superficie de eritrocito. Es la variabilidad en la composición de las porciones del carbohidrato de muchas glicoproteínas y glicolípidos de los eritrocitos que determinan las especificidades del grupo sanguíneo. Hay por lo menos 100 determinantes del grupo sanguíneo, la mayor parte son debido a las diferencias de carbohidratos. Los grupos sanguíneos mas comunes, A, B, y O, son especificados por la actividad especifica de productos de genes cuyas actividades son las de incorporar diferentes grupos de azúcar a los glicoesfingolipidos de las membranas de los glóbulos rojos así como también a las glicoproteínas secretadas.

Los complejos estructurales que involucran proteínas asociadas con lípidos por interacciones no covalentes se denominan lipoproteínas. Los distintos papeles de las lipoproteínas se describen en la página asociada correspondiente. Su principal función en el organismo es ayudar en el almacenamiento y transporte de lípidos y colesterol.

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Significado Clínico

Esta discusión no intenta ser una revisión completa de todos los desórdenes que resultan de defectos en estructura y la función de la proteína. Visite la página de errores innatos para un listado más completo de las enfermedades relacionadas con las proteínas anormales y también presiones en los links abajo para los ejemplos específicos para mayor información.

La substitución de un aminoácido hidrofóbico (V) por un aminoácido ácido (E) en la cadena-β de la hemoglobina resulta en anemia de la célula falciforme (HbS). Este cambio de un solo aminoácido altera la estructura de las moléculas de la hemoglobina de una manera tal que las proteínas desoxigenadas se polimerizan y precipitan dentro del eritrocito, conduciendo a su forma característica de hoz.

Los colágenos son las proteínas más abundantes del cuerpo. Las alteraciones en la estructura del colágeno que se presentan debido a anormalidades en los genes o a anormalidades en el procesamiento de las proteínas de colágeno el resultan en numerosas enfermedades, incluyendo el Síndrome de Larsen, el escorbuto, la osteogénesis imperfecta y el Síndrome de Ehlers-Danlos.

El termino Síndrome de Ehlers-Danlos en verdad es el nombre asociado con al menos diez alteraciones distintas que son bioquímica y clínicamente diferentes sin embargo todas ellas se manifiestan por una debilidad estructural del tejido conectivo debido a un defecto en la estructura del colágeno. La osteogénesis imperfecta también abarca más de un desorden. Se han identificado por lo menos cuatro alteraciones distintas bioquímica y clínicamente que se denomina osteogénesis imperfecta, todas estas se caracterizan por fracturas múltiples y resultan en deformidades del hueso. El Síndrome de Marfan se manifiesta como un desorden del tejido conectivo y se creía originalmente que era el resultado de colágenos anormales. Sin embargo, la evidencia reciente ha demostrado que el síndrome de Marfan resulta de mutaciones en la proteína extracelular, fibrilina, que es un componente integral de las microfibrillas no-colagenosas de la matriz extracelular.

Varias formas de hipercolesterolemia familiar son el resultado de defectos genéticos en el gen que codifica el receptor para la lipoproteína de baja densidad (LDL). Estos defectos dan lugar a la síntesis de receptores de LDL anormales que son incapaces de unirse al LDLs, o que se unen a LDLs pero los complejos receptor/LDL no se internaliza y no se degrada correctamente. El resultado es una elevación en los niveles de colesterol en el suero e incrementa la probabilidad de desarrollar ateroesclerosis.

Varias proteínas pueden contribuir a la transformación y a la carcinogénesis celular cuando su estructura básica es interrumpida por mutaciones en sus genes. Estos genes se llaman proto-oncogenes. Para algunas de estas proteínas, todo lo que se requiere para convertirlas a la forma oncogénica es una sola substitución en un aminoácido. Se ha observado que una sustitución en las posiciones 12 o 61 en el gen RAS, lleva a una alta frecuencia de carcinomas del colon. Las mutaciones en RAS son las alteraciones genéticas más frecuentemente observadas en cáncer de colon.

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Determinación de la Secuencia Amino-Terminal

Antes de secuenciar los péptidos es necesario eliminar los enlaces disulfuro dentro de los péptidos y entre los péptidos. Varias reacciones químicas se pueden utilizar para permitir la separación de los péptidos y prevenir conformaciones proteicas que son dependientes de puentes disulfuro. Los tratamientos más comunes son utilizar el 2-mercaptoetanol o el ditiotreitol (DTT). Ambos productos químicos reducen los enlaces disulfuro. Para prevenir la reformación de los enlaces disulfuro los péptidos se tratan con ácido yodoacético para alcalinizar los sulfhidrilos libres.

Hay tres importantes técnicas químicas para secuenciar los péptidos desde el N-terminal. Éstas son las técnicas de Sanger, Dansyl chloride y Edman.

Reactivo de Sanger: Esta técnica de secuenciamiento utiliza el compuesto, 2,4-dinitrofluorobenzeno (DNF) que reacciona con el residuo del N-terminal bajo condiciones alcalinas. El aminoácido derivado se puede hidrolizar y será etiquetado con un grupo dinitrobenzeno que imparte un color amarillo al aminoácido. La separación de los aminoácidos modificados (DNP-derivado) por electroforesis y la comparación con la migración de los estándares del DNP-derivado permite la identificación del aminoácido N-terminal.

Dansyl Chloride: Como el DNF, el Dansyl chloride reacciona con el residuo N-terminal bajo condiciones alcalinas. El análisis de los aminoácidos modificados se realiza similar al método de Sanger salvo que los aminoácidos dansylated son detectados por fluorescencia. Esto imparte una sensibilidad más alta a esta técnica que al del método de Sanger.

Degradación de Edman: La utilidad de la técnica de degradación de Edman es que esta permite la secuencia de aminoácidos adicionales desde le N-terminal hacia adentro. Usando este método es posible obtener la secuencia entera de péptidos. Este método utiliza fenilisotiocianato para reaccionar con el residuo del N-terminal bajo condiciones alcalinas. El aminoácido derivado feniltiocarbamil resultante se hidroliza en acido anhidro. La reacción de hidrólisis da lugar a un cambio del residuo N-terminal a un derivado feniltiohidantoina. Como en los métodos de Sanger y Dansyl chloride, el residuo N-terminal es etiquetado con un marcador identificable, sin embargo, la ventaja agregada del proceso de Edman es que el resto del péptido queda intacto. La secuencia entera de reacciones se puede repetir una y otra vez para obtener las secuencias del péptido. Este proceso ha sido automatizado para permitir secuenciar rápida y eficientemente hasta cantidades extremadamente pequeñas del péptido.

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Digestión de Proteasa

Debido a las limitaciones de la técnica de degradación de Edman, péptidos más largos de 50 residuos no se pueden secuenciar completamente. La capacidad de obtener péptidos de esta longitud, de las proteínas de mayor longitud, se facilita por el uso de enzimas, endopeptidasas, que se rompen en los sitios específicos dentro de la secuencia primaria de las proteínas. Los pequeños péptidos resultantes se pueden separar cromatográficamente y ser sometidos a las reacciones de secuenciamiento de la degradación de Edman.

Especificidades de Varias Endoproteasas

Enzima Fuente Especificidad Puntos adicionales
Tripsina Páncreas de bóvinos Enlace peptídico C-terminal a R, K, pero no si esta al lado de P altamente específico para residuos cargados positivamente
Quimotripsina Páncreas de bovinos Enlace peptídico C-terminal a F, Y, W pero no si esta al lado de P prefiere residuos hidrofóbicos abultados, rompe lentamente en N, H, M, L
Elastasa Páncreas de bovinos Enlace peptídico C-terminal a A, G, S, V del péptido, pero no si esta al lado de P  
Termolisina Bacilo termoproteoliticus Enlace peptídico N-terminal a I, M, F, W, Y, V, pero no si esta al lado de P prefiere residuos neutrales pequeños, puede romper en A, D, H, T
Pepsina Mucosa gástrica de bovinos Enlace peptídico N-terminal a L, F, W, Y, pero no cuando esta exhibe poca especificidad, requieren pH bajo
Endopeptidasa V8 Estafilococo aureus Enlace peptídico a C-terminal a E  

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Determinación de la Secuencia Carboxi-Terminal

No existen técnicas químicas confiables para el secuenciamiento de aminoácidos de péptidos en C-terminal. Sin embargo, hay enzima, las exopeptidasas, que se han identificado que rompen los péptidos en el residuo C-terminal que pueden entonces ser analizados cromatográficamente y ser comparados con los aminoácidos estándares. A esta clase de exopeptidasas se las llama carboxipeptidasas.

Especificidades de varios Exopeptidasas

Enzima Fuente Especificidad
Carboxypeptidasa A Páncreas de bovinos No romperá cuando el residuo C-terminal = R, K o P o si los residuos P están cerca del residuo terminal
Carboxypeptidasa B Páncreas de bovinos Rompe cuando el residuo C-terminal = R o K; no cuando P esta al lado del residuo terminal
Carboxypeptidasa C Hojas de frutos cítricos Todos los residuos libres C-terminal, a un grado óptimo de pH = 3.5
Carboxypeptidasa Y Levadura Todos los residuos libres C-terminal, lentamente en los residuos G

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Digestión Química de Proteínas

El reactivo químico más comúnmente utilizado que rompe los enlaces peptídicos por reconocimiento especifico de los residuos de aminoácidos es el bromuro de cianógeno (CNBr). Este reactivo causa ruptura específica en el lado C-terminal de los residuos M. El número de fragmentos peptídicos que resultan de la ruptura de CNBr son equivalentes a uno o más que el número de los residuos M de una proteína.

La técnica química más confiable para la identificación del residuo C-terminal es la hidrazinolisis. Un péptido es tratado con la hidrazina, NH2–NH2, a alta temperatura (90°C) por un largo periodo de tiempo (20–100hr). Este tratamiento rompe todos los enlaces peptídicos lo que produce amino-acil hidrazidos de todos los aminoácidos excepto el residuo C-terminal que se puede identificar cromatográficamente comparado con los estándares del aminoácido. Debido al alto porcentaje de reacciones laterales inducidas por la hidrazina esta técnica se utiliza solamente en los péptidos resistentes a la carboxipeptidasa.

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Cromatografía de Exclusión de Tamaño

Esta técnica cromatográfica se basa en el uso de un gel poroso bajo la forma de granos insolubles colocados en una columna. Mientras una solución de proteínas pasa a través de la columna, las proteínas pequeñas pueden penetrar en los poros de los granos y, por lo tanto, son retardados en su paso a través de la columna. Las proteínas más grandes tienen poca probabilidad de entrar en los poros. Diversos granos con diversos tamaños de poro pueden ser utilizados dependiendo del perfil deseado para la separación del tamaño de las proteínas.

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Cromatografía de Intercambio Iónico

Cada proteína individual tiene una carga neta distinta a un pH dado. Algunas proteínas están cargadas negativamente y algunas positivamente al mismo pH. Esta propiedad de las proteínas es la base para la cromatografía de intercambio de iones. Se utilizan resinas de celulosa fina que están negativa (intercambiador de catión) o positivamente (intercambiador de anión) cargadas. Las proteínas de carga opuesta a la resina son retenidas mientras que una solución de proteínas pasa a través de la columna. Las proteínas retenidas entonces son liberadas al hacer pasar una solución de iones que llevan una carga opuesta al de la columna. Utilizando un gradiente iónico de fuerza progresivamente mayor, las proteínas con mayor afinidad a la resina son lavadas progresivamente.

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Cromatografía de Afinidad

Las proteínas tienen altas afinidades por sus substratos o cofactores o grupos prostéticos o receptores o anticuerpos contra ellas. Esta afinidad se puede explotar en la purificación de proteínas. Se puede preparar una columna con granos que tenga el compuesto de alta afinidad y entonces se puede pasar una solución de proteínas a través de la columna. Las proteínas unidas entonces son lavadas al pasar una solución del compuesto soluble altamente afín a través de la columna.

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Cromatografía Líquida de alto Rendimiento (HPLC)

En la cromatografía de columna mientras más pequeña y más compacta este empacada la resina, la columna tiene mayor capacidad de separación En columnas de flujo por gravedad el empacamiento de la columna determina el tiempo que toma el paso de la solución de proteínas a través de la columna. El HPLC utiliza resinas de diámetro fino fuertemente empaquetas para impartir una resolución mas alta y supera las limitaciones del flujo al bombear las soluciones de proteínas a través de la columna bajo alta presión. Como la cromatografía de columna estándar, las columnas del HPLC se pueden utilizar para la exclusión por tamaño o por carga. Una técnica adicional de separación utilizada con HPLC es el uso de resinas hidrofóbicas para retardar el movimiento de proteínas no polares. Las proteínas entonces se lavan de la columna con un gradiente de concentración creciente de un solvente orgánico. Esta última forma de HPLC se llama HPLC inverso.

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Electroforesis de Proteínas

Las proteínas también se pueden caracterizar según tamaño y carga por la separación en una corriente eléctrica (electroforesis) dentro de geles sólidos hechos de acrilamida polimerizada y reticulada. La técnica más utilizada se llama electroforesis de gel de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE). El gel es una lámina fina de acrilamida polimerizada entre dos placas de cristal. Esta técnica utiliza un detergente negativamente cargado (sulfato dodecil de sodio) para desnaturalizar y solubilizar las proteínas. Las proteínas desnaturalizadas por el SDS tienen una carga negativa uniforme de tal manera que todas las proteínas migran a través del gel en el campo eléctrico basado solamente en su tamaño. Mientras más grande es la proteína se moverá más lentamente a través de la matriz del poliacrilamida. Luego de la electroforesis se analiza la distancia de migración de las proteínas desconocidas comparándolas con estándares o mediante varias tinciones o técnicas radiográficas de detección.

El uso de electroforesis de gel de poliacrilamida también puede ser utilizada para determinar la carga isoeléctrica de las proteínas (pI). Esta técnica se denomina de enfoque isoeléctrico. El enfoque isoeléctrico utiliza un tubo fino del poliacrilamida hecho por una mezcla de pequeñas moléculas cargadas positiva y negativamente llamadas los amfolitos. Los amfolitos tienen una gama de pIs que establecen un gradiente de pH a lo largo del gel cuando se aplica corriente. Las proteínas, por lo tanto, cesarán la migración en el gel cuando alcanzan el punto donde los amfolitos han establecido un pH igual a las proteínas pi.

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Centrifugación de Proteínas

Las proteínas se sedimentarán a través de una solución en un campo de centrifugación dependiente de su masa. La centrifugación analítica mide la proporción a la que las proteínas se sedimentan. La solución más común utilizada es un gradiente linear de la sucrosa (generalmente de 5–20%). Las proteínas son colocadas en la superficie del gradiente en un tubo de ultracentrifugación y luego son sujetas a centrifugación mayor a 100.000 x G. Los tamaños de proteínas desconocidas pueden entonces ser determinados comparando su distancia de la migración en el gradiente con las de proteínas estándares conocidas.

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Michael W King PhD | © 1996–2017 themedicalbiochemistrypage.org, LLC | info @ themedicalbiochemistrypage.org

Última modificación: 6 de abril de 2015