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Introducción

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

La medicina molecular moderna abarca la utilización de muchas técnicas biológicas moleculares en el análisis de la enfermedad, de los genes de la enfermedad y de la función de gene de las enfermedades. El estudio de los genes de las enfermedades y de su función en un individuo que no está afectado ha sido posible por el desarrollo de las técnicas de ADN recombinante y de clonación. La base del término ADN recombinante se refiere a la recombinación de diversos segmentos de ADN. La clonación se refiere al proceso de preparar múltiples copias de un tipo individual de molécula de ADN recombinante. Los mecanismos clásicos para producir moléculas recombinantes implican la inserción de fragmentos exógenos de ADN en vectores plásmidos derivados de bacterias (ADN doble circular de replicación autónoma que se encuentra en bacterias) o vectores basados en bacteriófagos (los virus que infectan bacterias). El término vector se refiere a la molécula de la ADN usada para llevar o para transportar ADN de interés hacia las células.

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Enzimas Comunes que se Utilizan en Biología Molecular

Enzima(s) Actividad Comentarios
Endonucleasas de restricción Reconoce secuencias especificas de nucleotidos y rompe al ADN dentro o cerca del sitio de reconocimient Ver abajo
Transcriptasa reversa (RT) Polimerasa retroviral codificada ARN-dependiente de ADN Se utiliza para convertir el ARNm en una copia de ADN complementario (cADN) con el propósito de clonar cADNs
RNasa H Reconoce dobles ARN-ADN y rompe aleatoriamente el esqueleto fosfodiester del ARN Se utiliza principalmente para romper la hebra de ARNm que esta alineada con la primera hebra de cADN que se genera por trascripción reversa
Polimerasa de ADN Síntesis de ADN Se utiliza en la mayoría de procedimientos en donde la síntesis de ADN es necesaria, también se utiliza en mutagénesis in vitro
Polimerasa Klenow ADN Fragmento proteolítico de la polimerasa de ADN que carece de la actividad de exonucleasa 5' ——> 3' Se utiliza para incorporar nucleotidos radioactivos en terminales generados por enzimas de restricción, también puede utilizarse en lugar de la polimerasa de ADN
Ligasa de ADN Une covalentemente un fosfato 5' libre a un hidroxilo 3' Se utiliza en todos los procedimientos en donde dos moléculas de ADN necesitan unirse covalentemente
Fosfatasa alcalina Retira fosfatos de los terminales 5' de moléculas de ADN Se utiliza para permitir que los terminales 5' puedan ser marcados radiactivamente con el γ-fosfato del ATP en presencia de la cinasa de Polinucleótidos, también se utiliza para prevenir la auto unión de plásmidos digeridos con enzimas de restricción y vectores lambda
Cinasa de Polinucleótidos Introduce al γ-fosfato del ATP al 5' terminal del ADN Ver anteriormente para fosfatasa alcalina
DNasa I Hidroliza aleatoriamente las uniones fosfodiester del ADN de doble hebra Se utiliza en la identificación de regiones de ADN que están unidas a proteína y por tanto protegidas de la digestión de DNAsa I, también se utiliza para identificar regiones de trascripción activas de la cromatina debido a que estas son más susceptibles de digestión por la DNasa
Nucleasa S1 exonuclease que reconoce un solo varados regiones de ADN utilizados para extraer las regiones de strandedness único en el ADN o ARN-ADN dúplex
Exonucleasa III Exonucleasa que elimina nucleotidos del 3' terminal de ADNs Se utiliza para generar deleciones en el ADN para el secuenciamiento, o para localizar dominios funcionales de dobles de ADN
Transferasa terminal ADN polimerasa que requiere solamente un 3'-OH, alarga los terminales 3' con cualquier dNTP Se utiliza para introducir colas homo poliméricas (los mismos dNTP) a los terminales 3' del ADN
Polimerasa RNA T3, T7 y SP6 Polimerasa ARN codificada en bacterias virus, reconoce secuencias especificas de nucleotidos para la iniciación de la transcripción Se utilizan para sintetizar ARN in vitro
Polimerasas de ADN Taq y Vent Polimerasas de ADN termoestables Se utiliza en PCR
Ligasas de ADN Taq y Vent Ligasas de ADN termoestables Se utiliza en PCR

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Endonucleasas de Restricción

Las endonucleasas de restricción son enzimas que reconocen, se unen e hidrolizan secuencias específicas de ácidos nucleicos en el ADN de doble-hebra. El término endonucleasa de restricción fue dado a esta clase de enzimas derivadas de bacterias puesto que fueron identificadas por estar implicadas en la restricción del crecimiento de ciertos bacteriófagos. Las bacterias son capaces de modificar secuencias específicas dentro de sus genomas por metilación lo que evita que su propio ADN sea reconocido por las enzimas de restricción codificadas por sus genomas. Este proceso se llama modificación y restricción. El ADN bacteriófago infectante no es modificado y, por lo tanto, no será digerido por las endonucleasas de restricción presentes en la bacteria.

La clave para la utilización in Vitro de las endonucleasas de restricción es su estricta especificidad de las secuencias de nucleótidos. Las diversas enzimas son identificadas por nombres que indica las bacterias de las cuales fueron aisladas, e.g. la enzima EcoRI que reconoce las secuencias, 5'–GAATTC–3', fue aislada de la Escherichia coli. Una característica única de las enzimas de la restricción es que las secuencias de nucleótido que reconocen son palindrómicas, es decir son las mismas secuencias en la dirección 5'——>3' de ambas hebras de ADN. Algunas endonucleasas de la restricción hacen cortes simétricos escalonados lejos del centro de su sitio de reconocimiento dentro del duplex de la ADN, algunas hacen cortes simétricos en el medio de su sitio de reconocimiento mientras que otras todavía rompen el ADN a distancia de la secuencia de reconocimiento. Enzimas que hacen que los cortes escalonados dejan el ADN resultante con extremos cohesivos o pegajosos. Las enzimas que rompen al ADN en el centro de la secuencia de reconocimiento dejan fragmentos de ADN que no tienen puntas.

Dos pedazos de ADN cualquiera que tengan las mismas secuencias dentro de sus extremos pegajosos se pueden alinear juntos y estar covalentemente ligados en presencia de la ligasa de ADN. Los fragmentos de terminaciones sin punta pueden ligarse independientemente de las secuencias al final de las hebras pareadas o duplex.

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Secuenciamiento del ADN

El secuenciamiento del ADN se puede lograr por medios químicos o enzimáticos. La técnica original para secuenciar, secuenciamiento de Maxam y Gilbert, se basa en la ruptura química específica de nucleótidos del ADN y ya no se utiliza más de forma rutinaria. La técnica enzimática, secuenciamiento de Sanger, implica el uso de dideoxinucleótidos (2',3'-dideoxi) que terminan la síntesis de ADN y es, por lo tanto, también denominado secuenciamiento de terminación de la cadena del dideoxi.

Sanger de secuenciamiento del ADN de protocolo

El protocolo del secuenciamiento de ADN de Sanger utiliza los dideoxinucleótidos (ddNTPs) para terminar el alargamiento de cadena de ADN durante su síntesis in Vitro a partir de una plantilla clonada. La síntesis se inicia utilizando una sonda de nucleotidos específica. Durante la reacción de síntesis, un nucleótido radiactivo (generalmente dATP) se incorpora en los filamentos que se están alargando. Cuatro reacciones separadas se realizan simultáneamente, las mismas que contienen los 4 dNTPs y un solo ddNTP. Mientras más alta es la concentración de ddNTP más frecuentemente terminará el alargamiento de cadena. Por lo tanto, uno puede regular el grado de la información de la secuencia obtenible variando el cociente de dNTP/ddNTP. Después de las reacciones de extensión los productos son resueltos por electroforesis en un gel de poliacrilamida de desnaturalización (de la urea). Se obtienen los resultados cuando el gel se seca y se expone a la película de radiografía. Las bandas cerca de la parte inferior del gel representan los productos de reacciones pequeñas (el más cercano al extremo 3' de la sonda) y aquellos cercanos a la parte superior del gel los productos más largos.

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Marco Teórico de la Clonación

Cualquier fragmento de ADN puede ser reproducido (clonado) una vez que se introduce en un vector apropiado para transformar a una bacteria huésped. La clonación se refiere a la producción de granes cantidades de moléculas idénticas de ADN y generalmente implica el uso de una célula bacteriana como huésped del ADN, aunque la clonación se pueda hacer también en células eucarióticas. La clonación del cADN se refiere a la producción de una biblioteca de ADNs clonados que representa todos los mRNAs presentes en una célula o en un tejido particular. La clonación del Genoma se refiere a la producción de una biblioteca de ADNs clonado que representa el genoma entero de un organismo en particular. De estos tipos de bibliotecas uno puede aislar (por una variedad de protocolos de investigación) una sola copia del cADN o del gene.

Para clonar cADNs o copias de genes se requiere de un vector para llevar el ADN clonado. Los vectores usados en biología molecular son de dos clases básicas. Una clase de vectores se deriva de plásmidos bacterianos. Los plásmidos son ADNs circulares que se encuentran en las bacterias que se replican autónomamente del genoma del huésped. Estos ADNs fueron identificados inicialmente porque tenían genes que conferían resistencia a los antibióticos a las bacterias. Los genes de resistencia antibióticos encontrados en los plásmidos originales se utilizan en plásmidos modernos diseñados in Vitro para permitir la selección de bacterias que han tomado los plásmidos que contienen el ADNs del interés. Los plásmidos son limitados en el sentido de que fragmentos de ADN menos de 10.000 bp (punto de ebullición) pueden ser clonados. En la práctica fragmentos de 5.000 bp son el límite.

La segunda clase de vectores se derivan del bacteriófago lambda (virus bacteriano). Este virus es capaz de la lisogenia (integración en el genoma del huésped) y de lisis (infección seguida por la lisis del huésped infectado). Los genes requeridos para la lisogenia se han quitado de los vectores lambda para permitir que solamente ocurra el ciclo vital lítico. La ventaja a los vectores lambda es que pueden llevar fragmentos de la ADN de hasta 25.000 bp. En el análisis del genoma humano incluso los vectores lambda son limitados y un sistema artificial de vector del cromosoma de la levadura (YAC) se ha desarrollado para la clonación de fragmentos de ADN de hasta 500.000 bp (véase abajo).

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Clonación del ADN Complementario (cADN)

Los cADNs son hechos a partir de los mRNAs de una célula por varias técnicas relacionadas entre si. Cada técnica consiste primero en la trascripción reversa del mRNA seguido por la síntesis del segundo filamento de ADN y de la inserción del cADN doble-hebra en un plásmido o vector lambda para la clonación. Este proceso crea una biblioteca de cADN clonado que representa cada especie del mRNA. La investigación de la biblioteca para una copia particular del cADN es realizada utilizando sondas a base de ácido nucleicos o de proteínas (proteínas o anticuerpos). Las bibliotecas cADN se pueden también estudiar por análisis biológicos de los productos generados por los cADNs clonados. La investigación con proteínas, anticuerpos o por análisis biológico son mecanismos para el análisis de la expresión de proteínas de los cADNs clonados y reciben el nombre de expresión de clonación. Las sondas "probes" de ácidos nucleicos se pueden generar de ADN (incluyendo oligonucleótidos sintéticos, óligos) o de ARN. Las sondas probes de ácidos nucleicos pueden marcarse con radioactividad o marcarse con nucleótidos modificados que son reconocibles por anticuerpos específicos y ser detectados por análisis calorimétricos o quimioluminescentes.

cADN clonación típico protocolo

Proceso típico para la producción y la clonación de cADN. Este ejemplo demuestra el uso de una sonda-adaptador específico que contiene las secuencias para la enzima de restricción NotI además del poli(T) para alinearse y recocer a la cola poli(A) del ARN. Es posible utilizar solamente el poli(T), o el poli(T) con otros sitios de restricción o sondas aleatorias (una mezcla de óligos que contienen secuencias al azar) para iniciar la primera reacción del filamento cADN. En algunos casos el inicio con el poli(T) no permite la extensión del cADN hacia el extremo-5 ' del ARN, el uso de sondas aleatorias puede superar este problema puesto que estas prepararán la primera síntesis de todo el filamento a lo largo del mARN. Esta técnica demuestra la ligadura de los adaptadores de EcoRI seguidos por digestión de EcoRI y de NotI. Este proceso permite que todos los cADNs sean clonados en una dirección, esto se llama reproducción direccional.

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Reproducción (clonación) Genómica

La mayoría de clonación genómica utiliza sistemas de vectores lambda. Estos sistemas son capaces de llevar de 15.000–25.000 bp de ADN. La clonación de fragmentos un poco más grandes de ADN geonómico puede realizarse utilizando un sistema quimérico plásmido- vector lambda llamado un cósmido. Los vectores cósmido contienen solamente los extremos cos (cohesivos) del genoma lambda (requerido para empaquetar la ADN en partículas virales infecciosas) junto con un gen de resistencia de antibióticos del plásmido y el origen de replicación del ADN. Puesto que aproximadamente 30.000bp del ADN de lambda han sido removidas en los vectores cósmidos, fragmentos genómicos más grandes de la ADN pueden ser clonados. Todavía fragmentos genómicos más grandes de ADN pueden ser clonados en vectores YAC (véase abajo).

El ADN geonómico se puede aislar de cualquier célula o tejido para su clonación. El ADN geonómico primero se digiere con las enzimas de restricción para generar fragmentos del tamaño óptimo para el vector que se esté utilizando para la clonación. Dado que algunos genes abarcan muchas más pares de bases de las que pueden ser insertadas en vectores convencionales de lambda o cósmido, los clones que están presentes en una biblioteca genómica deben traslaparse (superponerse). Para generar copias traslapadas, la ADN solamente se digiere parcialmente con las enzimas de restricción. Esto significa que no cada sitio de restricción, presente en todas las copias de un gene dado en la preparación del ADN, será roto. El ADN parcialmente digerido es entonces seleccionado por tamaño por una variedad de técnicas (e.g. electroforesis o centrifugación por gradiente) antes de la clonación. La investigación de bibliotecas genómicas se logra sobre todo con el uso de sondas de prueba a base de ácidos nucleicos. Sin embargo, pueden ser estudiadas con proteínas que se unan específicamente a secuencias de ADN (e.g. factores de trascripción). Un protocolo geonómico típico de clonación del ADN se esquematiza abajo.

ADN genómico clonación típico protocolo

Representación diagramática de un gen hipotético presente en una preparación de ADN geonómico. Los rectángulos indican que exones y las líneas que separan los rectángulos representan los intrones. Las flechas en negrilla indican las posiciones de los sitios de restricción de las enzimas, e.g. Sau3AI. Después de la digestión parcial de la enzima una amplia gama de diversos fragmentos del gene será generada, 4 fragmentos posibles se indican en la figura. Fragmentos en el rango de tamaño de 15–25 pares de kilo base (kbp) son purificados por electroforesis en gel o centrifugación por gradiente y ligados en un vector lambda. La ADN se empaqueta en partículas bacteriófagas in Vitro y se utiliza para infectar E. Coli.

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Clonación de ADN Geonómico en Vectores YAC

Los vectores de YAC permiten la clonación, dentro de células de levadura, de fragmentos de la ADN geonómico que se acercan a 500.000bp. Estos vectores contienen varios elementos de cromosomas de levadura típicos, por lo tanto el término YAC. Los vectores de YAC contienen un centrómero de la levadura (CEN), telómeros de la levadura (teléfono), (los telómeros son secuencias específicas que están presentes en los extremos de los cromosomas y son necesarias para la replicación) y una secuencia autónoma de replicación de levadura (ARS). Los ARSes de la levadura son esencialmente orígenes de replicación que funcionan autónomamente de la replicación de los orígenes de replicación del cromosoma de estas células. Los vectores de YAC también contienen genes, (e.g. URA3, un gene implicado en síntesis del uracilo) que permiten la selección de células de levadura que han tomado el vector. Para propagar el vector en células bacterianas, antes de la inserción del ADN geonómico, los vectores YAC contienen un origen de réplica bacteriano y un marcador de selección bacteriano como el gene de resistencia a la ampicilina.

En la clonación de ADN geonómico en un vector típico YAC, la ADN geonómico se digiere parcialmente con EcoRI y fragmentos en el rango de 400–500 pares del kilo base (kbp) son purificados por la electroforesis de gel de campo pulsado, PFGE. El vector de YAC se digiere con EcoRI y BamHI que coloca las secuencias del telómero en los extremos del vector alineado. El pequeño fragmento de BamHI es separado del resto del vector YAC por electroforesis de gel estándar. El ADN geonómico es entonces ligado en el vector y después se utiliza para transformar las células de levadura.

Genómica protocolo tí'pico clonación usando vectores YAC

Representación diagramática de un vector típico de YAC usado para clonar ADN geonómico. El vector contiene los telómeros de levadura (TEL), un centrómero (CEN), un marcador para seleccionar (URA3), y secuencias de replicación autónoma (ARS) así como también secuencias de plásmido bacterianas para la selección por antibióticos la y la replicación en la E. Coli.

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Análisis de Productos Clonados

El análisis de cADNs y de genes clonados involucra el uso de varias técnicas. La caracterización inicial implica generalmente la identificación y de la localización de diversos sitios de restricción de las enzimas. Esta información es útil para el secuenciamiento del ADN puesto que proporciona medios para digerir el clon en fragmentos específicos para la clonación-secundaria (subclonación), un proceso que implica la reproducción de fragmentos de un ADN particular que ha sido reproducido. Una vez que el ADN ha sido caracterizado completamente las copias del cADN pueden ser utilizadas para producir su ARN in Vitro y el ARN traducido in Vitro para caracterizar la proteína. Las clones de cADNs también pueden ser utilizadas como pruebas para analizar la estructura de un gen por "Southern blot" o para analizar el tamaño del ARN y el patrón de su expresión por "Northern blot". El Northern blot es también una herramienta útil en el análisis de la organización de exón-intrón de los clones de genes puesto que solamente los fragmentos de un gene que contienen exones se hibridizaran al ARN.

Southern blotting:

El Southern blot es el análisis de la estructura de ADN luego de su fijación a un soporte sólido. El ADN que se analizará, primero se digiere con una enzima de restricción, entonces los fragmentos de ADN resultantes se separan en un gel de agarosa. El gel se trata con el NaOH para desnaturalizar el ADN, después se neutraliza el NaOH. El ADN es transferido del gel a una lámina de nitrocelulosa o filtro de nylon por difusión capilar o por corriente eléctrica. El ADN es fijado al filtro por cocimiento al horno o por tratamiento con luz ultravioleta. El filtro se puede entonces sondar prob para determinar la presencia de un fragmento dado de ADN por varios medios radiactivos o no radiactivos.

Northern blotting:

El Northern blot implica el análisis del ARN luego de su fijación a un soporte sólido. El ARN es clasificado de acuerdo a su tamaño por electroforesis de gel, después es transferido a un soporte de nitrocelulosa o de filtro del nylon. La prueba del filtro para un ARN particular se hace de manera similar a la técnica de "Southern blot".

Western blotting:

El Western blotting implica el análisis de proteínas después su fijación a un soporte sólido. Las proteínas son separadas por su tamaño por medio de electroforesis SDS-PAGE y luego son transferidas a filtros de nitrocelulosa o de nylon. El filtro entonces se prueba con los anticuerpos que reconocen una proteína en particular.

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Análisis de Polimorfismo por Restricción de la Longitud de Fragmentos (PTFR)

La variabilidad genética en un locus particular (gen) debido incluso a cambios pequeños de poca importancia puede alterar el patrón de fragmentos producto de la digestión de enzimas de restricción. Las alteraciones patógenas al genotípico pueden deberse a deleciones (eliminación) o a inserciones dentro del gene que es analizado o inclusive a substituciones de nucleótido(s) que pueden crear o suprimir un sitio de reconocimiento de la enzima de restricción. El análisis del PTFR se aprovecha de esto y utiliza la prueba de Southern blot para analizar ADN geonómico digerido con enzimas de la restricción para detectar patrones familiares de los fragmentos de un gene dado, esta detección se hace por el estudio del gen con probandos correspondientes al gene del interés. Un ejemplo clásico de una enfermedad perceptible por el PTFR es la anemia de células falciformes.

La anemia de células falciformes resulta (a nivel del gene) de un solo cambio de nucleótido (de A a T) en el codón 6 dentro del gene de la β-globina. Esta alteración lleva la substitución del aminoácido Glu (G) por Val (v), mientras que al mismo tiempo se suprime el sitio de restricción de MstII. Consecuentemente un probando del gen de la β-globina se puede utilizar para detectar los diversos fragmentos de restricción de MstII. Debe recordarse que hay dos copias de cada gene en todas las células humanas, por lo tanto, el análisis del PTFR detecta ambas copias: el alelo afectado y el alelo no afectado.

La variabilidad del tamaño en fragmentos perceptibles dentro de un pedigrí familiar indica diferencias en el patrón de los sitios de restricción dentro y alrededor del gene que es analizado. Los patrones del PTFR se heredan y segregan en la manera mendeliana, permitiendo así su uso la geno-tipificación por ejemplo en casos de conflicto de paternidad o en investigaciones penales.

Otra forma de polimorfismo de ADN que se puede detectar por mapeo PTFR clásico resulta de las variaciones heredadas en el número de elementos que se repiten uno de tras de otro en la secuencia de ADN que son de 2 a 60 bp de longitud. El número de repeticiones es también variable a partir del 2 a 40 copias. Estos elementos se llaman las repeticiones en secuencia de número variable (VNTR; siglas en Inglés). Cuando la digestión de enzima de restricción corta el ADN que flanquea las VNTRs, las longitudes de los fragmentos resultantes serán variables dependiendo del número de repeticiones en un locus dado. Muchos y diversos locus de VNTR se han identificado y son extremadamente útiles para el análisis de huella digital del ADN por ejemplo en casos forenses y de identidad paternal.

Diagrama de un análisis de PTFR (RFLP)

Representación de un análisis de PTFR para la presencia del locus de células falciformes. El ADN geonómico se aísla y se digiere con la enzima de restricción MstII. Un sitio MstII se pierde en el locus de células falciformes. El ADN es entonces analizado por Southern blot y es probado con un probando especifico de la β-globina-específica que corresponde a extremo 5' del gene. Los individuos homocigóticos para los genes normales de la globina exhibirán una sola banda de la hibridación puesto que los genes maternales y paternales no están afectados. Los heterocigotos exhibirán la banda normal y la banda más grande del gene de las células falciformes. Los individuos homocigóticos para las células falciformes exhibirán una sola banda más grande hibridación.

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La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

La PCR es una técnica poderosa usada para amplificar el ADN millones de veces, por la repetida réplica de una plantilla, en un corto período de tiempo. El proceso utiliza sistemas de oligonucleótidos sintetizados in vitro específicos para preparar prime la síntesis de la ADN. El diseño de las sondas primers es dependiente de las secuencias de ADN que se desea estudiar. La técnica se realiza durante muchos ciclos (generalmente 20 - 50) de derretir la plantilla de ADN a alta temperatura, permitiendo que los primers se alineen a las secuencias complementarias dentro de la plantilla de ADN y después permitiendo la replicación de la plantilla con la polimerasa de ADN. El proceso se ha sido automatizado con el uso de polimerasas de ADN termoestables aisladas de bacterias que crecen en respiraderos termales en el océano o en fuentes de agua caliente. Durante la primera ronda de replicación, una sola copia de ADN se convierte a dos copias y así sucesivamente dando por resultado un aumento exponencial en el número de copias de las secuencias blanco de los primers. Después de apenas 20 ciclos una sola copia de ADN se amplifica más de 2.000.000 de veces.

Diagrama de la PCR protocolo

La reacción en cadena de la polimerasa se puede utilizar para amplificar una o las dos hebras de ADN (e.g. los productos de la reacción de la transcriptasa reversa, RT-PCR). La plantilla de ADN se mezcla con primers específicos o degenerados, dNTPs, buffer de polimerasa incluyendo el MgCl2 y polimerasa de ADN termoestable. La plantilla de ADN se desnaturaliza a alta temperatura (e.g. 95°C) y luego se enfría a una temperatura que permitirá el alineamiento óptimo de los primers. La temperatura de la reacción es entonces incrementada a la temperatura óptima para la polimerasa de ADN (e.g. 72°C) por el que los primers se extienden a lo largo de la plantilla de ADN. Esta serie de pasos se realiza 20–30 veces lo que lleva a la amplificación exponencial de la plantilla de blanco. La amplificación es tan grande que los productos de la reacción se pueden visualizar después por electroforesis en un gel.

Los productos del PCR son analizados por su separación en geles de agarosa seguidos por la coloración con bromuro de etidio y su visualización con trans-iluminación ultravioleta. Alternativamente, se pueden agregar dNTPs radiactivos a la PCR para incorporar un marcador a los productos. En este caso los productos del PCR son visualizados por la exposición del gel a una película de radiografía. La ventaja agregada de marcar con radioactividad los productos del PCR es se pueden cuantificar los niveles de productos individuales de la amplificación.

La PCR se puede utilizar en el análisis de genes enfermos pudiendo amplificar cantidades perceptibles de fragmentos específicos de ADN. Los fragmentos amplificados de genes en las enfermedades pueden ser más grandes, debido a las inserciones, o más pequeños, debido a las deleciones. La amplificación dramática del ADN por la PCR permite el análisis de genes patológicos en muestras extremadamente pequeñas de ADN. Por ejemplo, solamente una pequeña cantidad de células fetales necesitan ser extraídas del líquido amniótico para analizar para la presencia de genes específicos de la enfermedad. Además, mutaciones puntuales se pueden detectar por técnicas modificadas de PCR tales como la reacción en cadena de la ligasa (LCR) el análisis de PCR de polimorfismo conformacional de una hebra (PCR-SSCP). La técnica de PCR también se puede utilizar para identificar el nivel de expresión de genes en muestras extremadamente pequeñas de material, e.g. tejidos o células del cuerpo. Esta técnica se llama PCR de trascripción reversa (RT-PCR)

Ejemplos de desordenes heredados perceptibles por PCR

Enfermedad Gen Afectado
Immunodeficienciencia combinada severa, SCID adenosina deaminasa (ADA)
síndrome de Lesch-Nyhan hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa (HGPRT)
deficiencia de α1-antitripsina α1-Antitripsina
fibrosis quística proteína transmembrana de conductancia de la fibrosis quística (CFTR)
enfermedad de Fabry α-galactosidasa
enfermedad de Gaucher β-glucosidasa acida (glucocerebrosidasa)
enfermedad de Sandhoff hexosaminidasa A y B
enfermedad de Tay-Sachs hexosaminidasa A
hipercolesterolemia Familiar (FH) receptor LDL
deficiencia de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa glucosa-6-fosfato deshidrogenasa
enfermedad de miel de Maple de la orina deshidrogenasa α-ceto acida de cadena ramificada
Fenilcetonuria (PKU) fenilalanina hidroxilasa
deficiencia de ornitina transcarbamilasa ornitina transcarbamilasa
Retinoblastoma (Rb) producto del gen RB, pRB
nemia de células falciformes mutación puntual en la β-globina
β-Talasemia mutaciones en el gen de la β-globina que resulta en la perdida de síntesis de la proteína
Hemofilia A Factor VIII
Hemofilia B Factor IX
enfermedad de von Willebrand factor von Willebrand (vWF)

Trascripción Reversa-PCR (RT-PCR)

La RT-PCR es un procedimiento rápido y cuantitativo para el análisis del nivel de expresión de genes. Esta técnica utiliza la capacidad del transcriptasa reversa (RT) de convertir el ARN en cADN de una sola hebra y la acopla con la amplificación por PCR de tipos específicos de cADNs presentes en la reacción de RT. Los cADNs que se producen durante la reacción de RT representan una ventana en el patrón de genes que están siendo expresados en el momento en que el ARN fue aislado.

El ARN celular total se puede extraer de tejidos o de células por cualquiera de varias técnicas y se lo puede utilizar como plantilla para la RT. En la mayoría de los casos el ARN se prueba (prime) usando varias sondas (primers) aleatorias. Una pequeña alícuota de la reacción de RT se agrega entonces a una reacción PCR que contiene los primers específicos de las secuencias que uno desea amplificar. Los productos del RT-PCR pueden entonces ser visualizados como se describe anteriormente para la PCR estándar.

Polimorfismo conformacional de un Solo Filamento-PCR (PCR-SSCP)

Muchos desordenes heredados son debido a cambios de nucleótidos únicos dentro de regiones críticas del gen afectado (e.g. anemia de células falciformes). La técnica de PCR-SSCP puede detectar mutaciones de un nucleótido en los genes debido a la alteración en la movilidad de la conformación de las hebras individuales del ADN (en un gel de la electroforesis) que abrigan la mutación en relación a las hebras individuales del ADN que no tienen la mutación. Se hacen sondas ÒprimersÓ específicas que afectan la secuencia de un gen especifico asociado a una enfermedad en donde se sabe que existe la mutación esta región es entonces amplificada por PCR. La misma región del gen normal es también amplificada por PCR. Las dos hebras del producto del PCR normal emigrarán en forma diferentemente que los dos filamentos del producto del PCR mutante. Incluso las mutaciones puntuales llevan a los filamentos del ADN amplificado a tener diversas conformaciones que alteran su movilidad cuando estas son sujetadas a electroforesis en geles sin desnaturalización.

Para visualizar exactamente los productos del PCR luego de la electroforesis en gel, los primers son marcados con radioactividad o se incorporan nucleótidos radiactivos en los productos de la PCR. Los productos de la PCR se separan en un gel de poliacrilamida y son visualizados por la exposición del gel a una película de radiografía. Los individuos que son homocigotos normales en el locus que se esta analizando exhibirán dos bandas distintas en el gel así como los individuos que homocigotos para la mutación. Sin embargo, debido al cambio del nucleótido los productos de la PCR del mutante emigrarán con diversas movilidades en el gel. Los individuos que son heterocigotos exhibirán un patrón que consistente en las cuatro bandas.

Diagrama de un análisis de PCR-SSCP

Análisis de PCR-SSCP de genes normales y genes de la β-globina la anemia de células falciformes. La mutación A—>T se indica en azul. La región que rodea la mutación es amplificada por PCR y los productos separados en un gel de poliacrilamida sin desnaturalización. Los productos de la PCR del locus normal y del locus de células falciformes emigrarán en forma distinta debido a las conformaciones específicas en sus secuencias. Las personas homocigóticas normales exhibirán dos bandas al igual que las personas homocigóticas para la anemia falciforme (aunque de diferente tamaño que las normales). Las personas heterocigóticas en el locus de las células falciformes tendrán cuatro bandas.

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La Reacción en Cadena de la Ligasa (LCR)

La LCR es otra técnica que permite la detección de mutaciones puntuales únicas en genes con patología. La técnica utiliza una ligasa de ADN termoestable para unir perfectamente óligos adyacentes. Dos tipos de óligos se diseñan para recocer y unirse a un filamento del gene en el sitio de la mutación, un segundo tipo de dos óligos reconocen y se unen al otro filamento de ADN. Los óligos se diseñan de tal forma que recocerán solamente a las secuencias normales. En el ejemplo que se indica abajo para la mutación de células falciformes, el nucleótido 3' de uno de los óligos en cada par se une mal. Esta unión mal hecha previene el reconocimiento y alineamiento de los óligos directamente adyacentes. Por lo tanto, la ligasa de ADN no ligará los dos óligos de cada par. Con la secuencia normal los pares de óligos que se ligan se convierten en blancos para recocer y unirse a los óligos y, por lo tanto, dan lugar a una amplificación exponencial de las secuencia blanco normal. Debido a que se debe conocer con anterioridad las mutaciones para detectar mutaciones puntuales en genes patológicos, la técnica LCR se utiliza para el diagnostico de la presencia de un alelo del mutante en pacientes de alto riesgo.

Diagrama de la LCR protocolo

Tecnica de LCR utilizada para analzar el locus de celulas falciformes.

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Análisis del Microarray

El análisis del Microarray implica el uso de lo que comúnmente se llama "chips de genes" para determinar la expresión al mismo tiempo de un grupo grande de genes en un solo experimento. Los "chips de genes" se pueden comprar de varias compañías, e.g. Affymetrix, o pueden prepararse de acuerdo a las necesidades en laboratorios con el equipo apropiado. Los chips de genes de Affymetrix se hacen por medio de la unión covalente de oligonucleótidos sintéticos (óligos) a una pequeña superficie. Generalmente hay 20 o más diversos óligos en el chip que corresponde a diversas regiones de cada gene que se analizará. Además, se incluyen un número de óligos que contienen un nucleótido incorrecto como control negativo para cada gen. La tecnología para crear chips de genes es tal que puede haber miles de genes diferentes presentes en un solo chip cuadrado de aproximadamente 2cm.

Affymetrix gen chip

Affymetrix Gen Chip

Aunque haya numerosas aplicaciones para los chips de genes, el experimento más común implica una comparación de la expresión de genes en los chips de dos muestras, e.g. células cancerosas y células normales. El análisis se realiza preparando ARN de cada muestra y convirtiendo el ARN al cADN en presencia de los nucleótidos fluorescentes. Por ejemplo, una muestra de ARN se convierte a cADN con un nucleótido fluorescente verde y la otra muestra del ARN se convierte a cADN en presencia de un nucleótido fluorescente rojo. Esta preparaciones de cADN "marcadas" se llaman blancos y cantidades iguales de cada preparación blanco se mezclan juntas y después se hibridizan con chip de genes. Después de lavarse los blancos que no se hibridizaron un procesamiento de imagen del chip revelará puntos que son solamente verdes en un chip, sólo rojos, o un color entre éstos dos que representa una mezcla de cierto rojo y de cierto verde. Así, algunos puntos serán amarillos, algunos serán anaranjados o grados de la combinación estos colores intermedios. Los puntos que son solamente rojos indican que el gene fue expresado solamente en la fuente de los blancos marcados con rojo y vise versa para los puntos verdes. Los colores intermedios indican diversos niveles de expresión de un gene en ambas muestras. Con la ayuda de una computadora para determinar intensidad de la hibridación uno conseguirá un cuadro completo del nivel de expresión de cada gen en el chip en cada preparación ARN.

Matriz de selección de genes manchado resultado

Ejemplo de una matriz de ADN personalizado manchado de resultados

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Transgénesis

La transgénesis se refiere al proceso de introducir genes exógenos en el genoma de un organismo. Los primeros experimentos exitosos de la transgénesis fueron realizados en ratones. Un experimento relativamente bien conocido implicó la introducción del gen de la hormona de crecimiento de la rata en el genoma de ratones. Estos ratones transgénicos crecieron dos veces su tamaño normal.

Para crear un animal transgénico el gene del interés se debe pasar de generación en generación, es decir debe ser heredado en la línea del germen. Para lograr esto con ratones o los animales de ganado, los vectores que contienen el gene del interés con los elementos regulatorios apropiados (e.g. el promotor de la β-lacto globulina si se desea la expresión del transgén en la leche) se inyectan en el núcleo de huevos fertilizados. Los huevos entonces se trasplantan en el útero de las hembras receptivas para el desarrollo de la descendencia transgénica potencial. Para probar al animal resultante para la transmisión genómica del transgén el ADN cromosómico de su descendencia se prueba para ver la presencia del transgén. Si el transgén exhibe herencia mendeliana entonces se está transmitiendo en el genoma.

Actualmente el proceso de transgénesis se está utilizando en las industrias de plantas y ganado. La meta de la mayoría de estos experimentos es generar plantas y animales que sean más resistentes a las enfermedades y a las infecciones. Sin embargo, algunos animales transgénicos del campo como ovejas y las vacas se están desarrollando para obtener niveles de la expresión de proteínas ce interés terapéutico durante la síntesis de leche. Esto permite que granes cantidades de la proteína del interés puedan ser purificadas de la leche de los animales transgénicos.

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Terapia Génica

La transgénesis con los seres humanos permitiría la eliminación de genes patológicos en una población de descendientes, sin embargo, cuestiones técnicas y éticas prevendrán cualquier experimento transgénico con los óvulos humanos. Por lo tanto, la capacidad de sustituir genes con patologías por copias normales en seres humanos afectados es el objetivo último de la terapia génica. Los protocolos humanos de terapia génica apuntan introducir copias normales de genes patológicos en células somáticas individuos afectados. La expresión de una copia correcta de un gene afectado en células somáticas previene la transmisión a través de la línea gen mica, de tal modo, que se evita muchas de las implicaciones éticas la transgénesis. Esto es análogo al tratamiento de individuos por trasplante de órganos o tejidos.

Las técnicas más comunes utilizadas en estudios de la terapia génica es la introducción de un gene normal en células de la médula ósea, fibroblastos de la piel o hepatocitos. Los vectores más comúnmente utilizados se derivan de retrovirus y utilizan solamente las regiones promotoras de trascripción de estos virus (los LTRs) para conducir la expresión del gen del interés. La ventaja de los sistemas retrovirales de expresión es que la expresión ocurre en la mayoría de células.

Varios desordenes heredados en humanos se han corregido en células cultivadas y varias enfermedades (e.g. el melanoma malo y la enfermedad inmunodeficiencia combinada severa, SCID) están siendo tratadas actualmente por técnicas de terapia génica lo que indica que la terapia génica será probablemente una técnica terapéutica de gran alcance contra un grupo de enfermedades en los años que vienen.

Enfermedades en humanos tratadas en células de cultivo por terapia génica

Alteración Gen Afectado
SCID adenosina deaminasa (ADA)
SCID purina nucleósido fosforilasa
síndrome de Lesch-Nyhan hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa (HGPRT)
Enfermedad de Gaucher glucosidasa-β acida (glucocerebrosidasa)
Hipercolesterolemia familiar (FH) receptor de LDL
Fenilcetonuria (PKU) fenilalanina hidroxilasa
β-Talasemia β-globina
Hemofilia B Factor IX

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Última modificación: 6 de abril de 2015