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Introducción a las Enzimas

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Las enzimas son catálisis biológicas responsables de sostener casi todas las reacciones químicas que mantienen la homeostasis animal. Por su función en el mantenimiento de procesos de la vida, los ensayos y la regulación farmacológica de las enzimas se han constituido en elementos claves para el diagnostico clínico y terapéutico. La componentes macromoleculares de casi todas las enzimas están compuestas de la proteína, excepto para una clase de catalizadores de ARN conocido como ribozimas. La ribozima término se deriva de (en Inglés) ribonucleic acid enzyme. Las ribozimas son moléculas de ácido ribonucleico que catalizan reacciones en uno de sus propios enlaces fosfodiéster o dentro de otros ARN. Además, se conocen ribozimas que catalizan las reacciones de las proteínas, el mejor ejemplo es la actividad peptidiltransferasa de la subunidad ribosomal grande de la Síntesis de Proteínas.

Las enzimas se encuentran en todos los tejidos y fluidos del cuerpo. Las enzimas intracelulares catalizan las reacciones de las vías metabólicas. Las enzimas en las membranas celulares regulan reacciones en las células como respuesta a señales extracelulares, y las enzimas de la circulación son responsables de la regulación de la coagulación sanguínea. Casi todos los procesos significativos en biológica son dependientes de la actividad Enzimática.

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Clasificación de las Enzimas

Tradicionalmente, a las enzimas simplemente se les asignaba nombres a cargo del investigador que las descubría. Cuando el conocimiento se expandió, el sistema de clasificación de las enzimas se hizo complejo. Actualmente, a las enzimas se les agrupa en seis clases funcionales de acuerdo a la Unión Internacional de Bioquímicos (I.U.B).

Numero Clasificación Propiedades Bioquímicas
1 Oxidoreductasas Actúan sobre muchos grupos químicos para añadir o retirar átomos de hidrogeno
2 Transferasas Transfieren grupos funcionales entre moléculas aceptoras y donadoras. Las cinasas son transferasas especiales que regulan el metabolismo al transferir fosfatos desde el ATP a otras moléculas
3 Hidrolasas Añaden agua a través de los enlaces, hidrolizándolos.
4 Liasas Añaden agua, amoniaco o dióxido de carbono a través de enlaces dobles, o remueve estos elementos para producir enlaces dobles.
5 Isomerasas Realizan muchas clases de isomerizaciones: isomerizaciones L a D, reacciones de mutación (traslado de grupos químicos) y otras.
6 Ligasas Catalizan reacciones en las que dos grupos químicos se unen (o ligan) con el uso de energía del ATP

Las reglas dan a cada enzima un número. El sistema IUB también especifica un nombre textual para cada enzima. El nombre de la enzima esta hecho de los nombres del sustrato(s), producto(s), y la clase funcional de la enzima. Debido a que muchas enzimas, como las alcohol deshidrogenasas, son ampliamente conocidas en la comunidad científica por sus nombres comunes, el cambio a la nomenclatura aprobada por la IUB ha sido lento. En el uso del día a día, a la mayoría de enzimas se les continúa llamando por su nombre común.

A las enzimas también se les clasifica en base a su composición. Las enzimas formadas completamente de proteína se les conoce con el nombre simple de enzimas contrariamente a enzimas complejas, que están hechas de proteínas más una molécula orgánica relativamente pequeña. A las enzimas complejas también se les conoce con el nombre de holoenzimas. En esta terminología el componente proteico se conoce con el nombre de apoenzima, mientras que el componente no proteico se conoce con el nombre de coenzima o grupo prostético; en donde el grupo prostético describe un complejo en el que la molécula orgánica pequeña esta unida a la apoenzima por enlaces covalentes; cuando la unión entre la apoenzima y los componentes no proteicos no es covalente, la molécula orgánica pequeña se conoce con el nombre de coenzima. Muchos grupos prostéticos y coenzimas son derivados hidro-solubles de vitaminas. Debe indicarse que los síntomas clínicos más importantes de la deficiencia de vitaminas en la dieta generalmente aparecen por el mal funcionamiento de las enzimas, que carecen de cofactores suficientes derivados de las vitaminas para mantener la homeostasis.

El componente no proteico de una enzima puede ser tan simple como un ion metálico o tan complejo como una molécula orgánica pequeña no proteica. Las enzimas que requieren de un metal en su composición se conocen con el nombre de metaloenzimas si estas se unen y mantienen su átomo(s) de metal bajo todas las condiciones con una muy alta afinidad. Aquellas que tienen una afinidad mas baja para los iones metálicos, pero que aun requieren del metal para su actividad, se conocen con el nombre de enzimas activadas por metales.

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Papel de las Coenzimas

El papel funcional de las coenzimas es actuar como transportadores de grupos químicos desde un reactante a otro. Los grupos químicos que se transportan puede ser tan simples como un ion hidrogeno (H+ + 2e) transportado por el NAD o una mol de hidrogeno transportado por el FAD; o pueden ser mas complejos que la amina (–NH2) transportados por el fosfato de piridoxal.

Debido a que las coenzimas son químicamente cambiadas como consecuencia de la acción Enzimática, frecuentemente es util considerar a las coenzimas como una clase especial de sustratos, o segundos sustratos, que son comunes a muchas y diferentes holoenzimas. En todos los casos, las coenzimas donan el grupo químico que transportan a una molécula aceptora y así son regeneradas a su forma original. Esta regeneración de la coenzima y holoenzima cumple con la definición de una enzima como un catalizador químico, debido a que (a diferencia de los sustratos usuales, que son usados durante el curso de una reacción) las coenzimas generalmente se regeneran.

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La Enzima en Relación al Tipo de Sustrato

Aunque las enzimas son altamente específicas para el tipo de reacción que catalizan, lo mismo no es siempre la verdad sobre los sustratos que estas atacan. Por ejemplo, mientras la succinado deshidrogenasa (SDH) siempre cataliza reacciones de oxido-reducción y su sustrato es invariablemente el acido succínico, la alcohol deshidrogenasa (ADH) siempre cataliza reacciones de oxido-reducción pero ataca a varios diferentes alcoholes, que van desde el metanol al butanol. Generalmente, las enzimas que tienen una especificidad amplia de sustrato son mas activas con un sustrato en particular. En el caso de la ADH, el etanol es el sustrato preferido.

Las enzimas son también especificas para una configuración estérica particular (isómero óptico) de un sustrato. Las enzimas que atacan a un azúcar D no atacaran a su isómero L correspondiente. Las enzimas que actúan sobre un aminoácido L no utilizaran el isómero D correspondiente como un sustrato. Las enzimas conocidas con el nombre de racemasas proveen una excepción importante a estas generalizaciones; de hecho, el papel de las racemasas es convertir a los isómeros D a isómeros L y viceversa. Así, las racemasas atacan a las formas D y L de sus sustratos.

Como las enzimas tienen más o menos un amplio rango de especificidad de sustrato, entonces un sustrato determinado puede ser utilizado por un número diferente de enzimas, cada una de las cuales utiliza el mismo sustrato(s) y produce el mismo producto(s). Los miembros individuales de un grupo de enzimas que comparten tales características se conocen con el nombre de isozimas. Estas son productos de genes que varían muy poco; frecuentemente, varias isozimas de un grupo se expresan en diferentes tejidos del cuerpo. El grupo de isozimas mejor estudiado es el sistema de la lactato deshidrogenasa (LDH). La LDH es una enzima tetramérica compuesta de todos los arreglos posibles de dos subunidades proteicas diferentes. Las subunidades se conocen con el nombre de H (por corazón en ingles) y M (por músculo). Estas subunidades se combinan en varias maneras produciendo 5 isozimas distintas. La isozima hecha con solamente con subunidades H es característica del corazón, y la isozima M se encuentra en el músculo y en el hígado. Todas estas isozimas catalizan la misma reacción química, pero exhiben diferentes grados de eficiencia. La detección de isozimas de LDH especificas en la sangre es altamente diagnostica de daño tisular como ocurre en el infarto del corazón (ver mas abajo).

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Interacciones Enzima-Sustrato

El modelo mas favorecido de la interacción enzima sustrato se conoce como el modelo de ajuste inducido. Este modelo propone que la interacción inicial entre la enzima y el sustrato es relativamente débil, pero que estas interacciones débiles rápidamente inducen cambios conformacionales en la enzima que fortalecen la unión y atraen los sitios catalíticos en proximidad a los enlaces del sustrato que deben alterar. Después de que la unión se ha hecho, uno o más mecanismos de catálisis generan complejos de estado-de transición y productos de la reacción. Los posibles mecanismos de catálisis son cuatro:

1. Catálisis por tensión de enlace: en esta forma de catálisis, los rearreglos estructurales inducidos que se hacen con la unión del sustrato y enzima finalmente producen uniones de sustrato tensionadas, que mas fácilmente logran es estado de transición. La nueva conformación frecuentemente forza a los átomos del sustrato y a grupos catalíticos, como el glutamato y el aspartato, a conformaciones que tensan enlaces de sustrato existentes.

2. Catálisis por proximidad y orientación: las interacciones enzima-sustrato orientan los grupos reactantes y los juntan uno con otro. Además de inducir tensión, grupos como el aspartato son frecuentemente químicamente reactivos también, y su orientación y proximidad al sustrato favorecen su participación en la catálisis.

3. Catálisis que involucran donadores (ácidos) y aceptores (bases) de protones: otros mecanismos también contribuyen significativamente para completar los eventos catalíticos que se inician por mecanismos de tensión, por ejemplo, el uso de glutamato como un catalizado acido en general (donador de protones).

4. Catálisis covalente: en las catálisis que se realizan por mecanismos covalentes, el sustrato se orienta a los sitios activos de las enzimas de tal manera que se forma un intermediario covalente entre la enzima o la coenzima y el sustrato. Uno de los ejemplos mas conocidos de este mecanismo es el que involucra proteólisis por las proteasas de serina, que incluye a enzimas digestivas (tripsina, quimiotripsina, y elastasa) y varias enzimas de la cascada de la coagulación. Estas proteasas contienen en su sitio activo serina cuyo hidroxilo del grupo-R forma un enlace covalente con un carbono carbonilo de un enlace peptídico, por lo tanto causan hidrólisis del enlace peptídico.

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Reacciones Químicas y Velocidad (Proporciones) de Cambio

De acuerdo a las convenciones de la bioquímica, la proporción de cambio de una reacción química se describe por el numero de moléculas de reactante(s) que es convertida a producto(s) en un periodo de tiempo especifico. La proporción de cambio de la reacción siempre depende de la concentración de los químicos involucrados en el proceso y de las constantes que son características de la reacción. Por ejemplo, la reacción en la que A se convierte en B se escribe como sigue:

A ——> B

La proporción de cambio de esta reacción se expresa algebraicamente como una disminución en la concentración del reactante A:

–[A] = k[B]

O como un incremento en la concentración del producto B:

[B] = k[A]

En la segunda ecuación (de las 3 anteriores) el signo negativo significa una disminución en la concentración de A mientras la reacción procede, los corchetes definen la concentración en molaridad y la k se conoce como la constante de la proporción de cambio. Las constantes de la proporción de cambio son simplemente constantes de proporcionalidad que dan una conexión cuantitativa entre las concentraciones químicas y las proporciones de reacción. Cada reacción química tiene valores característicos para sus proporciones de cambio constantes; estas a su vez se relacionan directamente con la constante de equilibrio para esa reacción. Así, la reacción puede reescribirse como una expresión de equilibrio para demostrar la relación entre la proporción de la reacción, y las constantes de equilibrio y de proporción de cambio para este caso simple. La constante de cambio para la reacción hacia delante se define como K+1 y la reversa como k-1.

En equilibrio la proporción de cambio (v) de la reacción hacia delante (A ——> B) es, por definición, igual a la proporción de la reacción reversa o de regreso (B ——> A), una relación que algebraicamente se representa como:

Vadelante = vatras

En donde, para la reacción hacia adelante:

vadelante = k+1[A]

y para la reacción hacia atrás:

vatras = k–1[B]

En las ecuaciones anteriores, k+1 y k–1 representan constantes de cambio para la reacciones hacia delante y hacia atrás, respectivamente. El signo negativo se refiere a una reacción reversa, no a un valor negativo para la constante. Para poner las relaciones de las dos ecuaciones en palabras, establecemos que la proporción de cambio de la reacción hacia delante [Vadelante] es igual al producto de la constante de cambio hacia delante k+1 y la concentración molar de A. La proporción de la reacción reversa es igual al producto de la constante de cambio hacia atrás k–1 y la concentración molar de B.

En equilibrio, la proporción de cambio de la reacción hacia delante es igual a la proporción de la reacción reversa llevando a la constante de equilibrio de la reacción y se expresa:

Ecuación de la constante de equilibrio (Keq)

Esta ecuación demuestra que la constante de equilibrio para una reacción química no solamente es igual al radio de equilibrio de las concentraciones del producto y del reactante, sino que también es igual al radio a las constantes características de la reacción.

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Orden de las Reacciones Químicas

El orden de la reacción se refiere al número de moléculas involucradas en la formación de un complejo de reacción que es competente para producir un producto(s). Empíricamente, el orden se determina fácilmente sumando los exponentes de la concentración de cada término en la ecuación de la proporción de cambio para una reacción. Una reacción caracterizada por la conversión de una molécula de A a una molécula de B sin la influencia de ningún otro reactante o solvente es una reacción de primer orden. El exponente en la concentración del sustrato en la proporción de la ecuación para este tipo de reacción es 1. Una reacción con dos sustratos que forma dos productos es una reacción de segundo orden. Sin embargo, los reactantes en reacciones de segundo o de un orden más alto no tienen que ser de especies químicas diferentes. Un ejemplo de una reacción de segundo orden es la formación de ATP por la condensación de ADP con ortofosfato:

ADP + H2PO4 <——> ATP + H2O

Para esta reacción la proporción de cambio hacia delante seria escrita como:

vforward = k1 [ADP][H2PO4]

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Las Enzimas Como Catalizadores Biológicos

En las células y en los organismos la mayoría de reacciones son catalizadas por enzimas, que se regeneran en el curso de una reacción. Estos catalizadores biológicos son fisiológicamente importantes porque aceleran la proporción de las reacciones que de otra forma seria demasiado lenta para mantener la vida. Las enzimas incrementan las proporciones de cambio de las reacciones, algunas veces hasta un millón de veces, pero mas típicamente aproximadamente mil veces. Los catalizadores aceleran las reacciones en dirección hacia delante y su reverso en forma proporcional de tal forma que, aunque la magnitud de la constante de las reacciones hacia delante y su reverso se incrementa, el radio de las constantes de proporción de cambio permanece igual en presencia o ausencia de la enzima. Debido a que la constante de equilibrio es igual al radio de las constantes de proporción de cambio, es aparente que las enzimas y otros catalizadores no tienen efecto en la constante de equilibrio de las reacciones que estos catalizan.

Las enzimas incrementan la proporción de la reacción al disminuir la cantidad de energía que se requiere para formar un complejo de reactantes que es competente para producir productos en la reacción. Este complejo se conoce con el nombre de estado activado o estado de transición para la reacción. Las enzimas y otros catalizadores aceleran las reacciones al disminuir la energía del estado de transición. La energía libre que se requiere para formar un complejo activado es mucho mas baja en la reacción que es catalizada. La cantidad de energía que se requiere para lograr el estado de transición es mas bajo; consecuentemente, en cualquier momento una proporción más grande de moléculas en la población puede lograr el estado de transición. El resultado es que la proporción de cambio de la reacción se incrementa.

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Cinética de Michaelis-Menten

En reacciones típicas catalizadas por enzimas, las concentraciones de reactantes y productos son cientos o miles de veces mas grandes que la concentración de la enzima. Consecuentemente, cada molécula de la enzima cataliza la conversión a producto de muchas moléculas reactantes. En reacciones bioquímicas, a los reactantes se le conoce comúnmente con el nombre de sustratos. El evento analítico que convierte un sustrato a producto involucra la formación de un estado de transición, y este ocurre mas fácilmente en un sitio de unión especifico en la enzima. Este sitio, el sitio catalítico de la enzima, ha sido formado evolutivamente para proveer una unión específica de alta afinidad del sustrato(s) y para dar un medioambiente que favorece los eventos catalíticos. El complejo que se forma, cuando el sustrato(s) y la enzima se combinan, se llama el complejo enzima sustrato (ES). Los productos de la reacción aparecen cuando el complejo ES se rompe liberando a la enzima.

Entre la unión del sustrato a la enzima, y la aparición de la enzima libre y el producto, una serie de eventos complejos deben sucederse. Por lo menos se debe formar un complejo ES; este complejo debe pasar al estado de transición (ES*); y el estado de transición debe avanzar a un complejo enzima producto (EP). Este último es finalmente competente para disociarse en producto y enzima libre. La serie de eventos puede indicarse así:

E + S <——> ES <——> ES* <——> EP <——> E + P

La cinética de reacciones simples como la anterior fue caracterizada por primera vez por los bioquímicos Michaelis y Menten. Los conceptos que respaldan su análisis sobre la cinética Enzimática continúan aportando con la base para entender el metabolismo ahora, y para el desarrollo y uso clínico de fármacos dirigidos para selectivamente alterar constantes de proporciones de cambio e interferir con el progreso de los procesos de enfermedad. La ecuación de Michaelis-Melten es una descripción cuantitativa de la relación entre la proporción de una reacción catalizada por una enzima [V1], la concentración del sustrato [S] y dos constantes, Vmax y Km (que se establecen por la ecuación propia). Los símbolos utilizados en la ecuación de Michaelis-Melten se refieren a la velocidad de la reacción [V1], velocidad máxima de la reacción (Vmax), concentración del sustrato [S] y la constante de Michaelis-Melten (Km).

Michelis-Menten ecuación relativa a la velocidad inicial

La ecuación de Michaelis-Melten puede utilizarse para demostrar que a la concentración del sustrato que produce exactamente la mitad de la velocidad máxima de la reacción, i.e. ½ Vmax , la concentración del sustrato es numéricamente igual a la Km. Este hecho provee una herramienta bioanalítica simple pero util que se ha utilizado para caracterizar enzimas normales y alteradas, como las que producen síntomas de enfermedades genéticas. Reordenando la ecuación de Michaelis-Melten:

Obtención de Michelis-Menten constante (Km)

De esta ecuación debe ser aparente que cuando la concentración del sustrato es la mitad de la que se requiere para alcanzar la velocidad máxima de la reacción, la velocidad observada, V1, será igual a Vmax dividida para 2; en otras palabras, V1=[Vmax/2]. A esta concentración del sustrato la Vmax/ V1 será exactamente igual a 2, con el resultado que.

[S](1) = Km

El último es una afirmación algebraica del hecho de que, para enzimas del tipo de Michaelis-Melten, cuando la velocidad observada de la reacción es la mitad de la máxima velocidad posible, la concentración del sustrato es numéricamente igual a la constante de Michaelis-Melten. En esta derivación, las unidades de Km son aquellas que se utilizan para especificar las concentraciones de S, usualmente molaridad.

La ecuación de Michaelis-Melten tiene la misma forma que la ecuación para una hipérbole; el análisis grafico de la proporción de la reacción (V) versus la concentración del sustrato [S] produce un grafico de proporción hiperbólico.

Sustrato de la enzima-la curva de saturación

Concentración del sustrato versus la velocidad de la reacción

Las características claves del cuadro están marcadas por los puntos A, B, y C. A altas concentraciones de sustrato la velocidad representada por el punto C es casi igual a la Vmax, y la diferencia en la velocidad de la reacción a concentraciones cercanas del sustrato es casi inexistente. Si la curva de Michaelis-Melten se extrapola a concentraciones de sustrato infinitamente altas, la proporción extrapolada es igual a Vmax. Cuando la velocidad de la reacción se hace independiente (o casi) de la concentración de sustrato, se dice que la velocidad es de orden cero. Nótese que la reacción es de orden cero solamente con respecto a este sustrato. Si la reacción tiene dos sustratos, puede o no puede ser de orden cero en relación al segundo sustrato. Las diferencias muy pequeñas en la velocidad de la reacción a concentraciones de sustrato cercanas al punto C (cerca de Vmax) reflejan el hecho de que a estas concentraciones casi todas las moléculas de la enzima están unidas al sustrato y la velocidad de cambio es virtualmente independiente del sustrato, por tanto de orden cero. A concentraciones mas bajas, tales como en los puntos A y B, las velocidades mas bajas de la reacción indican que en cualquier momento solamente una porción de las moléculas de la enzima están unidas al sustrato. De hecho, a la concentración del sustrato indicada por el punto B, exactamente la mitad de las moléculas están en un complejo ES y la velocidad de cambio es exactamente la mitad de la Vmax. A concentraciones de sustrato cercanas al punto A la velocidad de cambio parece ser directamente proporcional a la concentración de sustrato, y la proporción de la reacción se dice ser de primer orden.

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Inhibición de Reacciones Catalizadas por Enzimas

Para evitar el tratamiento de gráficos curvilíneos de las reacciones catalizadas por enzimas, los bioquímicos Lineweaver y Burk introdujeron un análisis de la cinética Enzimática basándose en el siguiente rearreglo de la ecuación de Michaelis-Menten:

Lineweaver-Burke ecuación

Los gráficos de 1/V versus 1/[S] producen líneas rectas que tienen una inclinación de Km/Vmax y una intercepción en la ordenada a 1/Vmax

Lineweaver-Burke parcela

Representación Lineweaver-Burk

Una transformación linear alternativa de la ecuación de Michaelis-Melten es la de Eadie-Hofstee:

Eadie-Hofstee ecuación

Cuando V/[S] se representa en el eje de las Y versus V en el eje de las X, el resultado es un cuadro lineal con una inclinación de –1/Km y el valor Vmax/Km es el intercepto en el eje de las Y y Vmax es el intercepto en el eje de las X.

Las transformaciones de Lineweaver-Burk y Eadie-Hofstee de la ecuación de Michaelis-Menten son útiles para el análisis de la inhibición Enzimática. Debido a que la mayoría de la terapia farmacológica clínica se basa en la inhibición de la actividad Enzimática, el análisis de las reacciones enzimáticas utilizando las herramientas descritas anteriormente ha sido fundamental para el diseño moderno de fármacos. Ejemplos bien conocidos de tales terapias incluyen el uso de metotrexate en la quimioterapia del cáncer para inhibir semi-selectivamente la síntesis de DNA de las células malignas, el uso de la aspirina para inhibir la síntesis de prostaglandinas que son al menos parcialmente responsables de los dolores de la artritis, y el uso de sulfas para inhibir la síntesis del acido fólico que es esencial para el metabolismo y crecimiento de bacterias patógenas. Además, muchos venenos, como el cianuro, el monóxido de carbono y lo bifenoles policlorinados (PCB) causan sus efectos letales por la inhibición de enzimas.

Los inhibidores enzimáticos se clasifican en dos clases amplias: aquellos que causan inactivación irreversible de las enzimas y los que sus efectos inhibitorios pueden revertirse. Los inhibidores de la primera clase usualmente causan una modificación covalente inhibitoria de la estructura enzimática. El cianuro es un ejemplo clásico de inhibidor irreversible de enzima: al unirse en forma covalente a la citocromo oxidasa mitocondrial, el cianuro inhibe todas las reacciones asociadas con el transporte de electrones. El efecto cinético de los inhibidores irreversibles es disminuir la concentración de enzima activa, disminuyendo así las concentraciones máximas posibles del complejo ES. Debido a que la velocidad de actividad enzimática limitante es frecuentemente K2[ES], es claro que bajo estas circunstancias la disminución en la concentración de la enzima llevara a una disminución en la velocidad de la reacción. Nótese que cuando las enzimas están solamente parcialmente inhibidas por inhibidores irreversibles, las enzimas restantes que no están modificadas no se pueden distinguir de aquellas mismas enzimas en células no tratadas con el inhibidor; particularmente, estas enzimas tienen el mismo volumen (cantidad) y el mismo Km. La cantidad de enzima, en relación a la Vmax se define como el número máximo de moles de sustrato que pueden convertirse en producto por mol de sitio catalítico por segundo. Usualmente se considera que los inhibidores irreversibles son tóxicos y en general no son útiles para propósitos terapéuticos.

Los inhibidores reversibles se pueden dividir en dos categorías principales; inhibidores competitivos e inhibidores no competitivos, y una tercera categoría que rara vez se encuentra los inhibidores que no compiten.

Tipo de Inhibidor Sitio de unión en la Enzima Efecto cinético
Inhibidor competitivo Específicamente al sitio activo, en donde compite con el sustrato en un proceso dinámico de equilibrio. La inhibición es reversible por el sustrato Vmax no cambia; el Km esta incrementado, definido por la [S] que se requiere para llegar a la ½ de la actividad máxima de a reacción
Inhibidor no competitivo Se une a la E o al complejo ES en un sitio diferente al sitio activo. La unión al sustrato no se altera, pero el complejo ESI no puede producir producto. La inhibición no puede revertirse por el sustrato La Km no esta alterada. la Vmax disminuye proporcionalmente a la concentración del inhibidor
Inhibidor que no compite Se une solamente al complejo ES en sitios distintos al catalítico. La unión del sustrato modifica la estructura de la enzima, haciendo posible la unión del inhibidor. La inhibición no puede revertirse por el sustrato. Aparentemente la Vmax esta disminuida; la Km esta disminuida, definida por la [S] que se requiere para llegar a la ½ de la actividad máxima de a reacción

La característica de los inhibidores reversibles es que cuando las concentraciones del inhibidor caen, la actividad de la enzima se regenera. Usualmente estos inhibidores se unen a las enzimas por fuerzas no covalentes y el inhibidor mantiene un equilibrio reversible con la enzima. La constante de equilibrio para la disociación del complejo enzima-inhibidor se conoce como Ki:

Ecuación para el cálculo de constante de disociación de los complejos enzima-inhibidor

La importancia de la constante Ki es que en todas las reacciones enzimáticas en donde interactúan sustrato, inhibidor y la enzima, el Km y o la Vmax normales para la interacción sustrato-enzima parecen estar alterados. Estos cambios son una consecuencia de la influencia de Ki sobre la ecuación de la reacción. Los efectos de Ki se observan mejor en los cuadros de Lineweaver-Burk.

Probablemente los mejores inhibidores reversibles conocidos son los inhibidores competitivos, que siempre se unen al sitio catalítico o sitio activo de la enzima. La mayoría de fármacos que alteran la actividad Enzimática son de este tipo. Los inhibidores competitivos son especialmente útiles como moduladores clínicos de actividad Enzimática porque ofrecen dos rutas para la desinhibición de la actividad Enzimática afectada, mientras otros inhibidores reversibles solamente ofrecen una. Primero, como casi con la mayoría de inhibidores reversibles, una disminución en la concentración del inhibidor reversa el equilibrio regenerando enzima libre activa. Segundo, debido a que el sustrato y el inhibidor competitivo se unen al mismo sitio activo estos compiten uno con otro para unirse a este sitio específico de la enzima. El incremento de la concentración de sustrato (S), manteniendo la concentración del inhibidor sin cambiarla, da la segunda vía de revertir la inhibición competitiva. Mientras más alta la proporción del sustrato, mas alta es la proporción de la enzima presente en complejos competentes ES.

Como se indico anteriormente, concentraciones altas del sustrato pueden desplazar virtualmente a todo el inhibidor competitivo unido al sitio activo. Así, es aparente entonces que la Vmax no se cambia por acción de los inhibidores competitivos. Esta característica de los inhibidores competitivos se refleja en los interceptos idénticos del eje vertical de los gráficos Lineweaver-Burk, con y sin inhibidor.

Lineweaver-Burk parcelas de las enzimas inhibidas

Diagramas de inhibición enzimáticas de Lineweaver-Burk

Debido a que para lograr la Vmax se requiere concentraciones de sustrato apreciablemente más altas en presencia de un inhibidor competitivo, El Km (la concentración del sustrato a la mitad de la velocidad máxima) también es más alto, como se demuestra por el intercepto diferente negativo en el eje horizontal del panel B.

Igualmente, el panel C ilustra que los inhibidores no competitivos no parecen tener efecto en el intercepto en el eje de las X implicando que los inhibidores no competitivos no tienen efecto sobre el Km de las enzimas que inhiben. Debido a que los inhibidores no competitivos no interfieren en el equilibrio de una enzima, sustrato y complejo ES, las Kms de las enzimas tipo Michaelis-Menten no se afectan por los inhibidores no competitivos, como se demuestra por los interceptos en el eje de las X en el panel C. Sin embargo, debido a que los complejos que contienen inhibidores (ESI) son incapaces de progresar la reacción para producir productos, el efecto del inhibidor no competitivo es reducir la concentración de complejos ES que pudieran avanzar a producto. Debido a que Vmax = K2 [Etotal], y la concentración de Etotal competente esta disminuida por la cantidad de ESI que se ha formado, los inhibidores no competitivos se espera que disminuyan la Vmax, como se ilustra en el intercepto del eje de las Y en el panel C.

Un análisis similar de los inhibidores que no compiten llevan a pensar que estos inhibidores deben cambiar los valores aparentes de Km así como de Vmax. El cambio de estas dos constantes lleva a gráficos recíprocos dobles, en los que los interceptos en los ejes de las X y de las Y cambian proporcionalmente; esto lleva a la producción de líneas paralelas en reacciones inhibidas y no inhibidas, panel D.

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Regulación de la actividad Enzimática

Así como esta claro que las enzimas son responsables de las catálisis de casi todas las reacciones bioquímicas, es importante también reconocer que rara vez, (si alguna pasa) las reacciones enzimáticas suceden en forma aislada. El escenario más común es que las enzimas catalizan pasos individuales en vías metabólicas que tienen múltiples pasos, como es el caso de la glicólisis, gluconeogénesis o la síntesis de ácidos grasos. Como consecuencia de esta secuencia de reacciones, cualquier enzima depende de la actividad de reacciones precedentes para su sustrato.

En los humanos, la concentración del sustrato depende en la fuente de comida y usualmente no es un mecanismo fisiológico importante para la regulación de rutina de la actividad Enzimática. Por otro lado, la concentración de la enzima es modulada continuamente en respuesta a las necesidades fisiológicas. Se conocen tres mecanismos principales para regular la concentración de enzimas activas en los tejidos:

1. La regulación de la expresión de genes controla la cantidad y proporción de la síntesis Enzimática.

2. La actividad proteolíca determina la proporción de degradación Enzimática.

3. Modificaciones covalentes de pro enzimas inactivas pre-existentes producen enzimas activas.

La síntesis y degradación de las enzimas son mecanismos relativamente lentos para regular la concentración de las enzimas, con respuesta de horas, días o aun semanas. La activación de pro enzimas es un método más rápido para incrementar la actividad Enzimática pero, como mecanismo regulador, tiene la desventaja de no ser un proceso reversible. Generalmente las pro enzimas se sintetizan en abundancia, se almacenan en gránulos secretorios y se activan covalentemente luego de que han sido liberadas de su sitio de almacenamiento. Algunos ejemplos de pro enzimas importantes son el pepsinógeno, tripsinógeno, y quimiotripsinógeno, que dan origen a enzimas proteolíticas digestivas. De manera similar, muchas de las proteínas involucradas en la cascada de la coagulación se sintetizan como pro enzimas. Otras proteínas importantes, como las hormonas peptídicas y el colágeno, también se derivan por modificaciones covalentes de sus precursores.

Otro mecanismo para regular la actividad Enzimática es secuestrar las enzimas en compartimientos en donde el acceso a sus sustratos es limitado. Por ejemplo, la proteólisis de proteínas celulares y de los glicolípidos por las enzimas responsables de su degradación se controla secuestrando a estas enzimas dentro de los lisosomas.

Al contrario de los mecanismos que alteran la concentración de las enzimas, existe un grupo de mecanismos regulatorios que no afectan la concentración de las enzimas, son reversibles y de acción rápida, y que son los que regulan fisiológicamente a cada momento la actividad Enzimática. Estos mecanismos incluyen la regulación alostérica, regulación por modificaciones covalentes reversibles y regulación por proteínas de control como la calmodulina. La modificación covalente reversible es un mecanismo importante para la rápida y temporal regulación de la actividad Enzimática. Los mejores ejemplos, otra vez, vienen de estudios sobre la regulación del metabolismo del glicógeno en donde la fosforilación de la enzima glicógeno sintasa y de la cinasa de la glicógeno fosforilasa resulta en la estimulación de la degradación del glicógeno mientras que la síntesis del glicógeno es coordinadamente inhibida. Muchas otras enzimas del metabolismo intermedio se afectan por fosforilación, tanto positiva como negativamente. Estas fosforilaciones covalentes pueden ser revertidas por un sub-grupo aparte de enzimas llamadas fosfatasas. Estudios recientes han demostrado que la fosforilación aberrante de factores de crecimiento y de receptores hormonales, así como también de proteínas que regulan la división celular, frecuentemente conducen a un crecimiento celular sin control o cáncer. Los sitios usuales para añadir fosfatos a las proteínas son los residuos hidroxilos de los grupos-R de la serina, treonina y tirosina.

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Enzimas Alostéricas

Además de las enzimas simples que interactúan con solamente sustratos e inhibidores, existe un grupo de enzimas que se unen a moléculas fisiológicamente importantes y que modulan su actividad de formas diferentes a las descritas arriba. A estas se les conoce con el nombre de enzimas alostéricas; las moléculas regulatorias a las que estas enzimas se unen se les conoce con el nombre de moléculas efectoras. Los efectores alostéricos producen modificaciones catalíticas al unirse a las enzimas en distintos sitios alostéricos, muy distintos del sitio activo de las enzimas, y causan cambios conformacionales que se transmiten a través de toda la proteína hasta el sitio(s) activo catalítico.

La característica más importante de los efectores es que cuando estos se unen a las enzimas, estos alteran las propiedades catalíticas del sitio activo de la enzima. Aquellos que incrementan la actividad catalítica se conocen con el nombre de efectores positivos. Los efectores que reducen o inhiben la actividad catalítica son efectores negativos.

La mayoría de enzimas alostéricas son oligómeros (consisten en múltiples subunidades); generalmente se encuentran localizadas en o cerca de puntos de ramificación en las vías metabólicas, en donde influyen en la direccionalidad del sustrato en una u otra vía metabólicas disponible. Los efectores que modulan la actividad de estas enzimas alostéricas son de dos tipos. Los efectores activadores o inhibidores que se unen a los sitios alostéricos se llaman efectores heterotróficos (así, existen efectores heterotróficos positivos y negativos). Estos efectores pueden tener una gran diversidad de formas químicas, que van desde moléculas inorgánicas simples a nucleótidos complejos como el adenosina-monofosfato-cíclico (cAMP). Su única característica que los define es que estos no son idénticos a los sustratos.

En muchos casos el mismo sustrato induce efectos alostéricos distantes cuando se une al sitio catalítico. Los sustratos que actúan como efectores se llaman efectores homotrópicos. Cuando el sustrato es el efector, este puede actuar como tal, al unirse al sitio de unión del sustrato, o a un sitio efector allostérico. Cuando el sustrato se une al sitio catalítico transmite un efecto activador-modulatorio a otras subunidades de la molécula. Frecuentemente se utiliza como modelo homotrópico a la hemoglobina, aunque no es una enzima de ramificación y por tanto no cumple con la definición.

Existen dos formas por las que la actividad Enzimática puede alterarse por los efectores: la Vmax puede incrementarse o disminuirse, o el Km puede subirse o bajarse. Las enzimas cuyo Km se altera por los efectores se dice que son del tipo-K y los efectores, efectores tipo-K. Si la Vmax es alterada, la enzima y los efectores se dice que son del tipo-V. Muchas enzimas alostéricas responden a varios efectores con comportamiento tipo-K y tipo-V. Aquí también la hemoglobina se utiliza como modelo para estudiar las interacciones alostéricas, aunque estrictamente no es una enzima.

En la discusión previa asumimos que los sitios catalíticos y alostéricos estaban homogéneamente presentes en cada subunidad de una enzima alostéricas. Aunque este es frecuentemente el caso, existe otra clase de enzimas alostéricas que están formadas de subunidades catalíticas y regulatorias separadas. El arquetipo de esta clase de enzimas es la proteína-cinasa dependiente de cAMP (cAMP), cuyo mecanismo de activación se ilustra en la figura de abajo. La enzima es tetramérica, contiene dos subunidades catalíticas y dos subunidades regulatorias y enzimaticamente activas. Cuando los niveles intracelulares de cAMP se incrementan, una molécula de cAMP se une a cada unidad regulatoria, haciendo que el tetrámero se disocie en un dímero regulatorio y dos monómeros catalíticos. En la forma disociada, las subunidades catalíticas son completamente activas; estas catalizan la fosforilación de varias otras enzimas, como las involucradas en la regulación del metabolismo del glicógeno. Las subunidades regulatorias no tienen actividad catalítica.

Mediada por los receptores de regulación de la actividad de PKA

Vía que representa la activación de la proteína-cinasa dependiente de cAMP (PKA). En este ejemplo el glucagón se une a su receptor en la superficie de la célula, activando su receptor. La activación del receptor esta acoplada a la activación de una proteína-G acoplada al receptor (proteína que se une e hidroliza al GTP) compuesta de 3 subunidades. Luego de su activación la subunidad-α se disocia, se une y activa la adenilciclasa. La adenilciclasa entonces convierte el ATP a cAMP. El cAMP así producido entonces se une a las unidades regulatorias de la PKA llevando a su disociación de las subunidades catalíticas. Las subunidades catalíticas son inactivas hasta que se disocian de las subunidades regulatorias. Una vez que se liberan las subunidades catalíticas de la PKA fosforilan varios sustratos utilizando al ATP como donador de fosfatos.

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Las Enzimas en el Diagnostico de Enfermedades

Se ha demostrado que la determinación de los niveles séricos de varias enzimas es de importancia clínica. Esto es porque la presencia de estas enzimas en el suero indica que ha ocurrido daño tisular o celular, lo que resulta en la liberación de los componentes intracelulares a la sangre. Por lo tanto, cuando un médico indica que él va a medir las enzimas del hígado, el propósito es comprobar el potencial daño de las células del hígado. Las enzimas comúnmente analizadas son las aminotransferasas: transaminasa de alanina, ALT (algunas veces llamada aun glutamato-piruvato aminotransaminas sérica, sGPT), y la aspartato aminotransaminasa, AST (algunas veces llamada aun glutamato-oxaloacetato aminotransaminasa sérica, sGOT); lactato deshidrogenasa, LDH; creatin cinasa, CK (también llamada creatin-fosfocinasa, CPK); gamma-glutamil transpeptidasa, GGT. Otras enzimas se analizan en diferentes situaciones clínicas pero no serán tratadas aquí.

Las enzimas hepáticas típicas que se determinan son la AST y la ALT. La ALT es diagnostica de daño hepático porque esta enzima se encuentra predominantemente en los hepatocitos. Cuando se miden ambas la AST y la ALT el radio de los niveles de estas enzimas también puede ser de diagnostico. Normalmente en el daño o la enfermedad hepáticos que no es de origen viral el radio de ALT/AST es menor a 1. Sin embargo, con la hepatitis viral el radio ALT/AST será mayor a 1. La medición de la AST es util no solamente para detectar daño hepático sino también para detectar daño o enfermedad cardiaca. El incremento del nivel de AST en el suero es directamente proporcional al número de células involucradas así como también tiene relación con el tiempo transcurrido luego del daño del tejido hasta la medición de la enzima. Luego del daño, los niveles de AST se incrementan dentro de las primeras 8 horas y hacen un pico 24 a 36 horas mas tarde. Dentro de los 3 a 7 días los niveles de AST deben regresar a los niveles antes del daño, previendo que no este presente un daño continuo o que un nuevo insulto ocurra. Aunque la medición de AST no es, en si misma, diagnostico para infarto del corazón, en conjunto con las mediciones de LDH y CK (ver abajo), el nivel de AST es util para determinar el tiempo del infarto.

La medición de la LDH es esencial para el diagnostico de infarto del miocardio porque esta enzima existe en 5 formas muy relacionadas pero poco diferentes (isozimas). Los 5 isotipos y su distribución normal y sus niveles en ausencia de enfermedad o daño se indican abajo:

LDH 1 – se encuentra en el corazón y glóbulos rojos y es 17% – 27% del nivel sérico total

LDH 2 – se encuentra en el corazón y glóbulos rojos y es 27% – 37% del nivel sérico total

LDH 3 – se encuentra en una variedad de órganos y es 18% – 27% del nivel sérico total

LDH 4 – se encuentra en una variedad de órganos y es 3% – 8% del nivel sérico total

LDH 5 – se encuentra en el hígado y en el músculo esquelético y es 0% – 5% del nivel sérico total

Luego de un infarto cardiaco los niveles séricos de LDH se incrementan dentro de las 24–48 horas alcanzando un pico a los 2–3 días y regresan a valores normales a los 5–10 días. Especialmente diagnostico es una comparación del radio LDH-1/LDH-2. Normalmente, este radio es menor a 1. Una reversión de este radio se llama "LDH al revés". Luego de un infarto agudo del miocardio el LDH al revés aparecerá en 12–24 horas y esta definitivamente presente a las 48 horas en más del 80% de pacientes. También es importante el hecho de que en personas que sufren de dolor precordial debido solamente a angina, estos no tendrán valores alterados de LDH.

La CPK se encuentra primariamente en los músculos cardiaco y esquelético así como también en el cerebro. Por tanto, las mediciones de los niveles de CPK en el suero es un buen diagnostico de daño de estos tejidos. Los niveles de CPK se incrementaran dentro de las 6 horas luego del daño y harán un pico alrededor de las 18 horas. Si el daño no es persistente el nivel de CK regresa a lo normal en 2 a 3 días. Como la LDH, existen isozimas tejido específicas de CPK y sus designaciones se indican abajo:

CPK3 (CPK-MM) es la isozima predominante en el músculo y es 100% del nivel sérico total.

CPK2 (CPK-MB) corresponde al 35% de la actividad de la CPK en el músculo cardiaco, pero menos del 5% en el músculo esquelético y es el 0% del nivel sérico total.

CPK1 (CPK-BB) es la isozima característica del cerebro y esta en cantidades significativas en el músculo liso y es el 0% del nivel sérico total.

Debido a que la mayoría de la CPK liberada en un infarto del corazón es la CPK-MB, un radio elevado de CPK-MB a CPK total puede ayudar en el diagnostico de un infarto agudo, pero un incremento de CPK solamente no. Los niveles de CPK-MB se incrementan 3–6 horas del infarto del miocardio y hacen un pico entre las 12–24 horas mas tarde si no hay mas daño y regresan a valores normales a las 12–48 horas luego del infarto.

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Última modificación: 5 de abril de 2015