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El Complejo de la Piruvato Deshidrogenada (PDH)
La mayor parte del ATP utilizado por muchas células para mantener la homeostasis se produce por oxidación del piruvato en el ciclo del ácido tricarboxílico (ATC o ciclo de Krebs). Durante este proceso de oxidación, se generan nicotinamida adenina di nucleótido reducida (NADH) y flavina adenina di nucleótido (FADH2). NADH y FADH2 se utilizan principalmente para dirigir los procesos de fosforilación oxidativa, que son los responsables de convertir el potencial reducido del NADH y FADH2 al fosfato de alta energía ATP.
El destino del piruvato depende de la carga energía de la célula. En células o tejidos con alta carga de energía el piruvato es dirigido hacia la gluconeogénesis, pero cuando la carga de energía es baja, el piruvato se oxida a CO2 y agua en el ciclo ATC, con la generación de 15 equivalentes de ATP por cada piruvato. Las actividades enzimáticas del ciclo ATC (y la fosforilación oxidativa) se localizan en la mitocondria. Cuando el piruvato es transportado a la mitocondria, este encuentra dos enzimas metabólicas principales: la piruvato carboxilasa (una enzima de la gluconeogénesis) y la piruvato deshidrogenada (PDH), la primera enzima del completo PDH. Con una carga de energía alta en la célula la coenzima A (CoA) esta altamente acilada, principalmente como acetil.CoA, y capaz de activar alostéricamente a la piruvato carboxilasa dirigiendo al piruvato hacia la gluconeogénesis. Cuando la carga de energía es baja la CoA no esta acilada, la piruvato carboxilasa esta inactiva, y el piruvato es metabolizado preferentemente por la vía del complejo PDH y las enzimas del ciclo del ATC a CO2 y agua. El NADH y FADH2 reducidos que se general durante las reacciones oxidativas pueden entonces ser utilizados para dirigir la síntesis de ATP por la vía de la fosforilación oxidativa.
El complejo de la PDH se compone de varias copias de 3 enzimas separadas: la piruvato deshidrogenada (20 a 30 copias), dihidrolipoil transacetilasa (60 copias), y dihidrolipoil deshidrogenada (6 copias). El complejo también requiere de 5 coenzimas diferentes: CoA, NAD+, FAD+, ácido lipoico, y pirofosfato de tiamina (PPT). Tres de las coenzimas del complejo están unidas fuertemente a las enzimas del complejo (PPT, ácido lipoico, y FAD+) y dos se utilizan como transportadores de los productos de la actividad del complejo de la PDH (CoA y NAD+). La vía de la oxidación de la PDH del piruvato a acetil.CoA se ilustra a continuación.
Diagrama que ilustra el flujo de la actividad general del complejo de la piruvato deshidrogenasa. Durante la oxidación del piruvato a CO2 por la piruvato deshidrogenada los electrones fluyen del piruvato a la estructura de lipoamina de la dihidrolipoil transacetilasa, luego al cofactor FAD de la dihidrolipoil deshidrogenasa y finalmente a la reducción del NAD+ a NADH. El grupo acetil se une a la coenzima A (CoASH) en una unión tioester de alta energía. Luengo la acetil.CoA entra al ciclo del ATC para su oxidación completa a CO2 y H2O.
La primera enzima del complejo es la misma PDH que descarboxila oxidativamente al piruvato. Durante el curso de la reacción el grupo acetilo que se deriva de la descarboxilación del piruvato se une a la PPT. La siguiente reacción del complejo es la transferencia de los dos carbonos del grupo acetil a partir del acetil-PPT al ácido lipoico, la coenzima unida covalentemente a la lipoil transacetilasa. La transferencia del grupo acetil desde la acetil-lipoamida a la CoA da lugar a la formación de dos grupos sulfidrilos (SH) en el lipoato haciéndose necesario la re-oxidación de la forma disulfuro (S-S) para regenerar lipoato como un aceptor competente de grupos acilo. La enzima dihidrolipoil deshidrogenasa, con FAD+ como co-factor, cataliza esa reacción de oxidación. La actividad final del complejo PDH es la transferencia de equivalentes reducidos desde el FADH2 de la dihidrolipoil deshidrogenasa al NAD+. El destino del NADH es la oxidación en la vía de transporte de electrones de la mitocondria, para producir 3 equivalentes de ATP.
El resultado neto de las reacciones del complejo PDH es:
Piruvato + CoA + NAD+ ——> CO2 + Acetil-CoA + NADH + H+
Regreso al inicioRegulación del Complejo PDH
Las reacciones del complejo PDH sirven para interconectar las vías metabólicas de la glucólisis, gluconeogénesis, y síntesis de ácidos grasos al ciclo del ATC. Como consecuencia, la actividad del complejo PDH es muy regulado por una variedad de efectores alostéricos y por modificaciones covalentes. La importancia del complejo PDH al mantenimiento de la homeostasis se evidencia a partir del hecho de que aunque se han visto enfermedades asociadas con deficiencias del complejo PDH, los individuos afectados no llegan a la madurez. Debido a que el metabolismo energético de tejidos altamente aerobios como el cerebro depende de la conversión normal de piruvato a acetil.CoA, los tejidos aerobios son más sensibles a las deficiencias en los componentes del complejo PDH. La mayoría de enfermedades genéticas asociadas con deficiencias del complejo PDH se deben a mutaciones de la PDH. El resultado patológico más importante de tales mutaciones es la ácidosis láctica cerebral severa y las encefalopatías.
Factores que regulan la actividad de la piruvato deshidrogenasa (PDH). La actividad de la PDH se regula por su estado de fosforilación, siendo más activa en su estado de defosforilación. La fosforilación de la PDH es catalizada por una cinasa PDH específica. La actividad de la cinasa se incrementa cuando la carga de energía celular es alta lo que se refleja por un incremento en el nivel de ATP, NADH, y acetil.CoA. Contrariamente, un incremento de piruvato inhibe en forma marcada la activada de la PDH cinasa. Otros efectores negativos de la PDH cinasa son el ADP, NAD+, y CoASH, los niveles de los cuales se incrementa cuando la energía de la célula cae. La regulación de la PDH fosfatasa no ha sido completamente establecida pero se sabe que el Mg2+ y el Ca2+ activan a la enzima. En el tejido adiposo la insulina incrementa la actividad de la PDH y en el músculo cardiaco la actividad de la PDH se incrementa por las catecolaminas. "+ve" se refiere a un efecto positivo, "-ve" se refiere a la inhibición de la.
Dos productos del complejo, el NADH y la acetil.CoA, son efectores alostéricos negativos de la PDH-a, la forma no fosforilada, activa de la PDH. Estos efectores reducen la afinidad de la enzima por el piruvato, limitando así el flujo de carbonos a través del complejo PDH. Además, el NADH y la acetil.CoA son efectores positivos muy fuertes de la PDH cinasa, la enzima que inactiva a la PDH al convertirla en su forma fosforilada PDH-b. Debido a que el NADH y la acetil.CoA se acumulan cuando la carga de energía de la célula es alta, no es de sorprender que altos niveles de ATP también incrementan la actividad de la PDH cinasa, reforzando la disminución de la actividad de la PDH en células ricas en energía. Nótese de todas maneras que el piruvato es un efector negativo potente de la PDH cinasa, con el resultado de que cuando los niveles de piruvato se incrementan, la forma PDH-a se favorecerá aun con niveles altos de NADH y acetil.CoA.
Las concentraciones de piruvato que mantienen la forma activa de la PDH (PDH-a) son lo suficientemente altas para que, en células ricas en energía, la forma de la PDH con un Km alto que esta alostéricamente disminuida, sea capaz de convertir el piruvato a acetil.CoA. Con concentraciones altas de piruvato en células que tienen alta carga de energía y altas concentraciones de NADH, los carbones del piruvato serán dirigidos hacia las dos formas de almacenamiento de carbonos (glicógeno vía gluconeogénesis y producción de grasa vía la síntesis de ácidos grasos) en donde la acetil.CoA es el principal donador de carbonos.
Aunque no se conoce bien la regulación de la PDH-b fosfatasa, es muy posible que tenga regulación para maximizar la oxidación del piruvato bajo condiciones de baja energía y minimizar la actividad de la PDH bajo condiciones de lata energía.
Regreso al inicioReacciones del Ciclo del Ácido Tricarboxílico (ATC)
El ciclo del ATC que indica las enzimas, sustratos y productos. El GTP que se genera en la reacción succinato tiocinasa (succinil-CoA sintetasa) es equivalente a una mol de ATP debido a la presencia de la nucleótido fosfocinasa. Las tres moles de NADH y 1 mole de FADH2 que se generan durante cada vuelta del ciclo alimentan la vía de la fosforilación oxidativa. Cada mole de NADH da lugar a 3 moles de ATP y cada mole de FADH2 da lugar a 2 moles de ATP. Por tanto, por cada mol de piruvato que entra en el ciclo del ATC, se pueden generar 12 moles de ATP. IDH=isocitrato deshidrogenasa. α-KGDH=α-cetoglutarato deshidrogenasa. MDH=malato deshidrogenasa. Coloque el cursor sobre los intermediarios del ciclo para ver sus estructuras. rxn = reacción
Citrato sintasa (enzima condensadora):
La primera reacción del ciclo es la condensación del carbono metilo de la acetil.CoA con el carbón ceto (C-2) del oxaloacetato (OAA). La energía libre estándar de la reacción, –8.0 kcal/mol, la dirige fuertemente hacia delante. Debido a que la formación del OAA a partir de sus precursores es termodinámicamente no favorable, la naturaleza altamente exergónica de la reacción de la citrato sintasa es de una importancia central para que el ciclo se mantenga funcionando hacia delante, debido a que se dirige la formación de oxaloacetato por principios de acción de masa.
Cuando la carga de energía de la célula se incrementa la tasa de flujo a través del ciclo del ATC disminuirá lo que llevara a un incremento de citrato. El exceso de citrato se utiliza para transportar los carbones de la acetil.CoA desde la mitocondria al citoplasma en donde pueden ser utilizados para la síntesis de ácidos grasos y colesterol. Adicionalmente, los niveles altos de citrato en el citoplasma activan la enzima regulatoria clave de la síntesis de los ácidos grasos, acetil.CoA carboxilasa (ACC) e inhibe la PFK-1. En tejidos no hepáticos el citrato se requiere también para la síntesis de cuerpos cetónicos.
Aconitasa:
La isomerización de citrato a isocitrato por la aconitasa es estéreo especifica, con la migración de –OH del carbono central del citrato (anteriormente el carbón ceto del OAA) siendo siempre hacia el carbono adyacente que se deriva del metileno (–CH2–) del OAA. La naturaleza estéreo específica de la isomerización determina que el CO2 perdido, cuando el isocitrato se oxida a succinil-CoA, se derive del oxaloacetato utilizado par la síntesis del citrato.
La aconitasa es una de varias enzimas mitocondriales conocidas como proteínas no-heme-hierro. Estas proteínas contienen hierro inorgánico y azufre, que se conocen como centros de hierro y azufre, en un complejo coordinado con azufres de cisteina de la proteína. Existen dos clases prominentes de complejos no-heme-hierro, aquellos que contienen dos equivalentes cada uno de hierro inorgánico y azufre Fe2S2, y aquellos que contienen 4 equivalentes de cada uno Fe4S4. La aconitasa es miembro de la clase Fe4S4. Sus centros de azufre frecuentemente se designan como Fe4S4Cys4, que indica que 4 átomos de azufre de la cisterna están envueltos es la estructura completa del complejo. En los compuestos sulfuro el hierro esta envuelto en los eventos de oxidación-reducción.
Isocitrato deshidrogenasa:
El isocitrato es descarboxilado oxidativamente a α-cetoglutarato por la isocitrato deshidrogenada, (IDH). Existen dos enzimas IDH diferentes. La IDH del ciclo del ATC usa NAD+ como cofactor, mientras que la otra IDH utiliza NADP+ como cofactor. A diferencia de la enzima que requiere NAD+, que solamente se encuentra en la matriz mitocondrial, la enzima que requiere NADP+ se encuentra en la mitocondria y en el citoplasma. La IDH cataliza la reacción limitante así como también la primera reacción que produce NADH del ciclo del ATC. El CO2 que se produce por la reacción de la IDH es el C-1 original del oxaloacetato que se utiliza en la reacción citrato sintasa.
Generalmente se considera que el control del flujo de carbonos del ciclo se regula en la reacción de la IDH por los efectores alostéricos negativos poderosos NADH y ATP y por los efectores positivos poderosos; isocitrato, ADP, y AMP. Por esto último es claro que la carga energética de la célula es un factor clave en la regulación del flujo de carbono en el ciclo del ATC.
El complejo α-cetoglutarato deshidrogenasa:
El α-cetoglutarato es descarboxilado oxidativamente a succinil-CoA por el complejo α-cetoglutarato deshidrogenada (α-CGDH). Esta reacción genera el segundo equivalente del ciclo del ATC CO2 y NADH. Este complejo multi-enzimático es muy similar al complejo PDH en lo intrincado de sus proteínas y su estructura, cofactores, y su mecanismo de acción. También, como en el complejo de la PDH, las reacciones del complejo de la α-CGDH proceden con una gran carga de energía libre estándar. Aunque el complejo de la α-CGDH no esta sujeto a modificaciones covalentes, la regulación alostérica es muy compleja, con su actividad regulada por la carga de energía, el radio NAD+/NADH, y la actividad efectora de sustratos y productos.
La succinil-CoA y el α-cetoglutarato son también metabolitos importantes fuera del ciclo del ATC. Así, el α-cetoglutarato, representa un metabolito anapletórico que facilita la entrada y salida de átomos de carbono del ciclo del ATC a vías que involucran el metabolismo de aminoácidos. El α-cetoglutarato es también importante para dirigir el transportador malato-aspartato. La succinil-CoA, junto con la glicina, contribuye con todos los átomos de carbono y nitrógeno que se requieren para la síntesis de heme protoporfirina y para la utilización de cuerpos cetónicos en tejidos no hepáticos.
Succinil-CoA Sintetasa (Succinato Tiocinasa):
La conversión de succinil-CoA a succinato por acción de la Succinil-CoA Sintetasa involucra el uso del tioésteres de alta energía de la succinil-Coa para dirigir la síntesis de un nucleótido de fosfato de alta energía, por un proceso denominado fosforilación a nivel de sustrato. En este proceso se forma un intermediario enzima-fosfato, y luego el fosfato es transferido al GDP. El GTP mitocondrial se utiliza en una reacción de trans-fosforilación catalizada por una enzima mitocondrial la cinasa difosfo nucleosidasa para fosforilar al ADP, y así producir ATP y regenerar GDP para facilitar la acción continua de succinil CoA sintetasa.
Succinato deshidrogenasa (SDH)
La SDH cataliza la oxidación del succinato a fumarato con la reducción secuencial de FAD unido a la enzima y del hierro no hemínico. En las células de mamíferos el aceptor final de electrones es la coenzima Q10 (CoQ10), un transportador móvil de equivalentes reducidos que por su naturaleza lipofílica esta restringido a la fase lipídica de la membrana mitocondrial.
Fumarasa (fumarato hidratasa):
La fumarasa cataliza reacciones especificas para la forma trans del fumarato. El resultado es que la hidratación del fumarato procede de forma estero específica con la producción de L-malato.
Malato deshidrogenasa (MDH):
El L-malato es el sustrato específico para la MDH, la última enzima del ciclo del ATC. La reacción hacia delante del ciclo, la oxidación del malato produce oxaloacetato (OAA). En la reacción hacia delante la reacción tiene una energía libre estándar de aproximadamente +7kcal/mol, lo que indica la naturaleza no favorable de la dirección de la reacción hacia delante. Como se indico anteriormente, la reacción de la citrato sintasa que condensa el OAA con la Acetil.CoA tiene una energía libre estándar de aproximadamente –8kcal/mol y es responsable de tirar la reacción de la MDH hacia delante. El promedio de cambio en la energía libre estándar es de aproximadamente –1kcal/mol para la conversión de malato a OAA y a succinato.
La estequiometría promedio del ciclo del ATC es:
acetil-CoA + 3NAD+ + FAD + GDP + Pi + 2H2O ——> 2CO2 + 3NADH + FADH2 + GTP + 2H+ + HSCoA
Regreso al inicioRegulación del Ciclo del Ácido tricarboxílico (ATC)
La regulación del ciclo del ATC, como el de la glucólisis, se hace a la entrada de los sustratos al ciclo así como también en reacciones claves del mismo. La energía entra al ciclo del ATC principalmente como acetil.CoA. La generación de acetil.CoA a partir de los carbohidratos es, por tanto, un punto de control importante del ciclo. Esta es la reacción catalizada por el complejo PDH.
En forma de revisión, el complejo PDH se inhibe por la acetil.CoA y el NADH y se activa por la CoA no acetilada (CoASH) y el NAD+. Las actividades de la piruvato deshidrogenasa del complejo PDH se regulan por su estado de fosforilación. Esta modificación se lleva a cabo por la cinasa especifica (PDH cinasa) y los fosfatos son eliminados por una fosfatasa especifica (PDH fosfatasa). La fosforilación de la PDH inhibe su actividad, y por tanto, lleva a una disminución en la oxidación del piruvato. La PDH cinasa se activa por el NADH y por la acetil.CoA y se inhibe por el piruvato, ADP, CoASH, Ca2+, y Mg2+. La PDH fosfatasa, por el contrario, se activa por el Mg2+, y el Ca2+.
Debido a que tres reacciones del ciclo del ATC así como también de la PDH utilizan NAD+ como cofactor no es difícil entender por que el ratio de NAD+/NADH de la célula tiene un gran impacto en el flujo de carbonos en el ciclo del ATC.
La disponibilidad de sustrato puede también regular el flujo del ciclo del ATC. Esto ocurre en la reacción de la sintasa de citrato como un resultado de la disminución en la disponibilidad de oxaloacetato. La inhibición por producto de la reacción también ocurre en el ciclo del ATC, por ejemplo, el citrato inhibe la sintasa de citrato, la α-CGDH se inhibe por el NADH y la succinil-CoA. Las enzimas clave del ciclo del ATC también son reguladas alostéricamente por el Ca2+, ATP, y ADP.
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Michael W. King, Ph.D / IU School of Medicine / miking at iupui.edu